鈣蛋白酶在嚴重燒傷大鼠骨骼肌消耗中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　嚴重燒傷后機體處于物質能量高分解代謝狀態(tài),作為人體最大氮庫的骨骼肌是受分解代謝影響最大的器官,致傷后極長的一段時間內骨骼肌會陷入嚴重的消耗狀態(tài)。骨骼肌嚴重消耗將導致機體免疫力下降,感染率增加等,嚴重影響患者的生存質量和預后。我們實驗室既往研究表明,嚴重燒傷后骨骼肌消耗主要源于泛素-蛋白酶體活化引發(fā)的肌原纖維蛋白降解增加。然而,泛素-蛋白酶體途徑不能直接降解肌原纖維蛋白,而有賴于鈣蛋白酶( calcium-activat

2、ed neutral protease,calpain)等其它途徑作用產生可被泛素-蛋白酶體降解的蛋白。鈣蛋白酶是細胞內依賴鈣的中性半胱氨酸酶,通過Ca2+激活進而表現出蛋白水解酶活性。新近研究表明,鈣蛋白酶在許多高代謝病理狀態(tài)引發(fā)的骨骼肌消耗中起著重要作用。為進一步闡明嚴重燒傷后骨骼肌消耗的機制,為臨床治療提供實驗依據,本研究擬通過嚴重燒傷動物模型和體外細胞實驗探討:
　　(1)嚴重燒傷大鼠骨骼肌消耗、骨骼肌超微結構及鈣蛋白酶活

3、性變化規(guī)律;
　　(2)鈣蛋白酶活化導致嚴重燒傷大鼠骨骼肌消耗的作用機制;
　　(3)嚴重燒傷后大鼠骨骼肌鈣蛋白酶活化的原因;
　　(4)鈣離子泵抑制劑丹曲林對嚴重燒傷后骨骼肌消耗的影響及初步機制。
　　方法:
　　第一部分:
　　(動物實驗)雄性Wistar大鼠80只(180~210g),隨機分為假燙組(n=40)和燙傷組(n=40),背部浸入94℃熱水12s、腹部6s制備50％體表面積(total

4、 body area surface,TBSA)III度燙傷動物模型。于傷后0d、1d、4d、7d、14d(n=8)五個觀察點,采集腹主動脈血和骨骼肌標本。采用大鼠體重、大鼠肌肉重量/體重比評估燙傷大鼠骨骼肌消耗情況;透射電鏡觀察骨骼肌超微結構變化;實時定量熒光PCR檢測calpain-1及calpain-2表達水平;Western blot免疫印跡檢測脛骨前肌中 calpain-1、calpain-2蛋白表達水平;熒光定量檢測鈣蛋白酶

5、活性。
　　第二部分:
　　(動物實驗)雄性Wistar大鼠72只隨機分為3組,假燙組(n=24)、燙傷組(n=24)和抑制劑組(n=24)。燙傷組和抑制劑組制備50%TBSAIII度燙傷。傷后抑制劑組采用腹腔注射MDL28170(鈣蛋白酶抑制劑,24mg/kg)給藥,1/24h。假燙組和燙傷組大鼠給予等量溶液(2%DMSO的林格氏液)。傷后1d、7d、14d(n=8)三個觀察點采集脛骨前肌標本。采用大鼠體重、大鼠肌肉重量/

6、體重比評估燙傷大鼠骨骼肌消耗情況;定量檢測脛骨前肌中游離肌絲含量;SDS-PAGE分析游離肌絲中肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯蛋白的含量;熒光定量檢測骨骼肌中鈣蛋白酶、26S蛋白酶體及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性;原位末端轉移酶標記(Tunel)染色檢測肌組織細胞凋亡;Western blot免疫印跡分析脛骨前肌中calpain-1、calpain-2、肌動蛋白、肌球蛋白以及蛋白酶體C2亞基蛋白表達水平,胞漿和線粒體中活化

7、Bid(truncated Bid,tBid)、細胞色素c(Cytochrome c, Cyt c)、calpain-2蛋白含量,以及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、糖原合成酶-3β((glycogen synthesis kinase,GSK-3β)和叉形頭轉錄因子3a(Forkhead box O3a,FoxO3a

8、)總蛋白和磷酸化蛋白水平。
　　(細胞實驗)體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌 L6細胞分為對照組、calpain-2過表達組、calpain-2過表達+抑制劑組。對照組采用含有終濃度為5mM CaCL2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng);calpain-2過表達組細胞轉染pGMLV-calpain-2-PA1慢病毒3d后,用含有終濃度為5mM CaCL2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng);calpain-2過表達+抑制劑組細胞轉染慢病毒3d后,用含有5mM CaCL2和10nM

9、 MDL28170的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)0h、6h和24h后收集細胞,AnnexinV/PI染色流式檢測細胞凋亡情況;熒光定量檢測L6細胞中caspase-3活性;Western blot免疫印跡分析胞漿和線粒體中tBid、細胞色素c、calpain-2蛋白含量。
　　第三部分:
　　(動物實驗)雄性Wistar大鼠80只隨機分為假燙組(n=40)和燙傷組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=40)。傷后0d、1d、4d、7d、14

10、d五個觀察點(n=8),采集脛骨前肌標本。電子探針 X射線顯微分析法檢測骨骼肌細胞胞漿、線粒體、肌漿網三微區(qū)內Ca2+含量;實時定量熒光PCR檢測脛骨前肌中鈣蛋白酶激活蛋白和鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastin) mRNA水平;Western blot免疫印跡分析calpastin蛋白表達;熒光定量檢測骨骼肌中鈣蛋白酶活性。
　　(細胞實驗) L6細胞分為對照組和實驗組兩組,對照組細胞用含有10%假傷大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基孵育、

11、實驗組細胞用含10%燙傷大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基孵育。孵育0h、6h、24h、48h后,Fluo4-AM檢測細胞胞漿中Ca2+濃度,熒光定量檢測L6細胞中鈣蛋白酶活性。
　　第四部分:
　　(動物實驗)雄性Wistar大鼠56只隨機分為假燙組(n=8)、燙傷組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=24)和丹曲林組(50%TBSAⅢ°燙傷,n=24)。傷后假燙組、燙傷組尾靜脈注射5%甘露醇,丹曲林組尾靜脈注射丹曲林鈉2 mg/kg(溶

12、于5%甘露醇),傷后1d、4d、7d三個觀察點采集脛骨前肌標本,稱量體重及骨骼肌重量。透射電鏡觀察骨骼肌超微結構變化;電子探針 X射線顯微分析法檢測骨骼肌細胞三微區(qū)內 Ca2+含量;Western blot免疫印跡分析脛骨前肌中 calpain-1、calpain-2蛋白表達;熒光定量檢測骨骼肌中鈣蛋白酶活性。
　　結果:
　　第一部分:
　　(1)50%TBSA III度燙傷后大鼠體重以及脛骨前肌(快肌)重量明顯降低

13、,燙傷組脛骨前肌/體重比明顯低于假燙組(P<0.05),傷后7d最為顯著;
　　(2)傷后燙傷組骨骼肌肌原纖維出現溶解、斷裂、Z線局部消失,并伴有線粒體腫脹和空泡化現象,與肌組織損傷動態(tài)變化基本一致;
　　(3)傷后燙傷組大鼠脛骨前肌calpain-1和calpain-2蛋白及mRNA表達水平均升高,其中蛋白水平于傷后4d達到峰值;
　　(4)傷后鈣蛋白酶的活性持續(xù)上升,于傷后7d達到峰值。
　　第二部分:

14、>　　(1)燙傷后大鼠脛骨前肌游離肌絲明顯增加,肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯蛋白含量顯著增加,鈣蛋白酶活性升高,傷后7d達到極值。應用鈣蛋白酶抑制劑后脛骨前肌游離肌絲未見明顯增加,肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯蛋白含量顯著低于燙傷組,鈣蛋白酶活性一直處于較低水平;
　　(2)嚴重燙傷后脛骨前肌中26S蛋白酶體活性及C2亞基蛋白表達升高,顯著高于假燙組。加入鈣蛋白酶抑制劑后,26S蛋白酶體活性及 C2亞基蛋白表達與同時間點燙傷組相比明顯下降;

15、
　　(3)燙傷組骨骼肌 Tunel核凋亡指數、caspase-3活性顯著高于假燙組,傷后7d差異最為顯著,給予鈣蛋白酶抑制劑后,肌組織細胞凋亡指數、caspase-3活性明顯低于燙傷組。燙傷組和抑制劑組脛骨前肌胞漿和線粒體中 calpain-2蛋白表達均顯著升高,但同時間點抑制劑組蛋白表達低于燙傷組;傷后各組胞漿中 Bid蛋白表達差異不顯著,但線粒體中tBid蛋白表達存在顯著差異,傷后1d、7d燙傷組線粒體中tBid蛋白表達顯著

16、升高,抑制劑組tBid蛋白表達明顯低于燙傷組;細胞色素 c蛋白在假燙組和抑制劑組脛骨前肌胞漿中表達較少,燙傷后隨時間延長燙傷組胞漿中細胞色素c蛋白含量顯著升高,傷后7d燙傷組胞漿中細胞色素c含量顯著高于假燙組和抑制劑組,同時線粒體中細胞色素c含量明顯減少,傷后7d燙傷組線粒體中細胞色素c含量顯著低于假燙組和抑制劑組。體外細胞實驗中calpain-2過表達的 L6細胞凋亡率和 caspase-3活性顯著升高,與對照組差異顯著,抑制劑組細胞

17、凋亡率和caspase-3活性略有升高,但低于過表達組。過表達組和抑制劑組胞漿中calpain-2蛋白表達沒有顯著差異,但過表達組細胞線粒體內calpain-2隨著孵育時間的增加而升高,顯著高于抑制劑組;L6細胞線粒體及胞漿內tBid含量與calpain-2蛋白的變化趨勢相似。過表達組L6細胞線粒體中細胞色素c蛋白含量逐漸降低,胞漿中細胞色素c蛋白的逐漸升高,24h后達到極值。抑制劑組中細胞胞漿及線粒體中細胞色素c蛋白變化趨勢同過表達組

18、,但兩組存在顯著差異;
　　(4)嚴重燒傷后脛骨前肌中Akt、mTOR、GSK-3β和FoxO3a蛋白的磷酸化水平顯著降低,給予鈣蛋白酶抑制劑后,傷后1d和7d的 Akt、mTOR、GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著高于燙傷組。
　　第三部分:
　　(1)燙傷組大鼠傷后脛骨前肌細胞漿、線粒體 Ca2+升高,肌漿網Ca2+含量降低,傷后1d Ca2+變化達到極值。燙傷組calpastatin mRNA表達水平呈現先降低后升高

19、的趨勢,傷后1d和4d的 calpastatin mRNA水平明顯低于假燙組,燙傷組calpain activator的mRNA傷后略有變化,與假燙組沒有顯著差異。傷后脛骨前肌中 calapastatin蛋白表達下降,傷后4d顯著低于假燙組;
　　(2)燙傷血清孵育L6細胞引起胞漿內Ca2+含量升高,隨著孵育時間延長,Ca2+含量增加,鈣蛋白酶活性升高。
　　第四部分:
　　(1)鈣通道RyR受體阻滯劑丹曲林明顯抑制細

20、胞胞漿及線粒體內Ca2+超載,丹曲林組傷后1d、4d細胞胞漿、線粒體內 Ca2+含量明顯低于燙傷組;
　　(2)丹曲林組傷后肌組織超微結構與對照組相比未見明顯變化;
　　(3)calpain-1和calpain-2蛋白表達水平顯著低于燙傷組;
　　(4)丹曲林組鈣蛋白酶的活性雖有略有波動,但仍顯著低于燙傷組。丹曲林治療有效降低骨骼肌消耗,緩解燒傷導致的體重及脛骨前肌/體重比變化。
　　結論:
　　(1)嚴重

21、燒傷后鈣蛋白酶活化是嚴重燒傷后骨骼肌消耗的重要原因?；罨拟}蛋白酶可通過裂解肌原纖維、釋放游離肌絲、上調下游泛素-蛋白酶體途徑的活性,啟動和加速蛋白降解;活化的鈣蛋白酶激活線粒體凋亡途徑促進細胞凋亡;同時鈣蛋白酶還通過抑制 Akt活性及其信號通路下游分子磷酸化,抑制蛋白合成、促進骨骼肌消耗。
　　(2)細胞內持續(xù)Ca2+超載及鈣蛋白酶抑制蛋白低表達是嚴重燙傷后骨骼肌胞漿內的鈣蛋白酶活化的主要原因。
　　(3)鈣蛋白酶抑制劑(