非小細胞肺癌反殺傷T淋巴細胞的實驗研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文非小細胞肺癌反殺傷T淋巴細胞的實驗研究姓名：王海東申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（胸心外）指導教師：蔣耀光20080501第三軍醫(yī)大學博士學位論文以及凋亡的改變，探討腫瘤自身表達的Fas／FasL對其自身活性的影響，即腫瘤是否可通過自身表達的Fas／FasL引起自殺。另外由于T細胞可以通過自分泌方式凋亡，即T細胞自身表達的Fas／FasL可以引起T細胞自身凋亡，因此用抗FasL抗體(NOK一1)封閉細胞本身的Fa

2、sL表達，利用MTT和流式細胞儀方法，檢測封閉FasL表達與否細胞活力及凋亡的改變。第三部分首先采用膠原酶原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，傳代培養(yǎng)后用免疫組織化學的方法，用VIII因子相關抗原鑒定，同時用免疫組織化學方法檢測HUVEC細胞Fas表達的情況；另外利用Jurkat細胞來作為活化的T淋巴細胞，將A549轉染pSiFasL、A549轉染psiNEGativeRNAi兩組細胞分別與HUVEC和Jurkat細胞混合培養(yǎng)，

3、同時分別用流式細胞儀檢測不同效靶比、NOK一1封閉FasL表達與否，HUVEC和Jurkat細胞凋亡的情況。實驗的主要結果如下：1各組siRNA質粒干擾效率存在差異。WesternBlot結果證實在Fas—siRNA的設計中pSi—Fasl的DNA序列遵循了其中Angela六條原則，而其它兩個DNA序列則遵循了Angela五條原則，pSi—Fasl干擾效果最好；FasL—siRNA的設計中pSi—FasL2的DNA序列遵循了其中Ange

4、la六條原則，而其它兩個DNA序列則遵循了Angela五條原則，pSi—FasL2干擾效果最好。將pSi—Fasl、pSi—FasL2轉染A549細胞后即得到Fas／FasL被特異性基因靜默的肺腺癌細胞株。2親代A549細胞在基因和蛋白水平均低表達Fas、Caspase一3、Caspase8，高表達FasL；A549細胞轉染pSi—Fas后在基因和蛋白水平均低表達Fas、Caspase一3、Caspase8，高表達FasL；A549細胞

5、轉染pSi—FasL后在基因和蛋白水平均低表達Fas、FasL、Caspase一3、Caspase一8；A549轉染psiNEGativeRNAi后在基因和蛋白水平均低表達Fas、Caspase3、Caspase一8，高表達FasL。MTT和流式細胞儀結果顯示三組細胞在細胞活力和凋亡方面沒有變化。3MTT和流式細胞儀結果顯示親代A549細胞和A549轉染psiNEGativeRNAi在是否NOK1封閉FasL表達，其細胞活力及凋亡均無改