基于piggyBac轉座子的轉基因家蠶絲腺表達Higf-Ⅰ的研究.pdf

1、胰島素樣生長因子-Ⅰ(human Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，hIGF-Ⅰ)是一類具有細胞分化和增殖功能，并具有胰島素樣作用的多肽。它應用的范圍越來越廣，但是hIGF-Ⅰ供應的相對不足成了應用的的主要障礙之一。家蠶絲腺是一個高度分化的組織，具有非常強的蛋白合成及分泌能力，因此在生產(chǎn)基因藥物方面絲腺反應器有著很好的應用前景。
　　 為了實現(xiàn)轉基因家蠶絲腺生物反應器實現(xiàn)hIGF-Ⅰ的分泌表達，提高重組蛋

2、白表達水平，簡化提取工藝，用家蠶絲膠(ser-1)啟動子控制絲素重鏈基因fib-H信號肽和hIGF-Ⅰ融合基因構建基于piggyBac轉座子的轉基因載體pigA3GFP-serHS-hIGF-Ⅰ-neo，通過精子介導法導入家蠶，對篩選獲得轉基因家蠶進行hIGF-Ⅰ的表達水平檢測。通過piggyBac轉座子介導成功將fib-H信號肽和hIGF-Ⅰ融合基因表達盒整合進入家蠶基因組，并實現(xiàn)表達目的蛋白部分分泌進入絲腺腔并最終到達蠶絲絲膠層。在

3、轉基因家蠶G1代每克新鮮中部絲腺組織中hIGF-Ⅰ的表達水平約為43.8 ng左右，每克蠶繭中hIGF-Ⅰ的含量大約為46.7 ng左右。結果表明絲素重鏈基因fib-H信號肽在中部絲腺組織可引導重組蛋白的分泌表達，提高表達水平。
　　 此外，用家蠶絲素Fhx/P25啟動子驅動hIGF-Ⅰ，構建了轉基因載體pigA3GFP-Fhx/P25-hIGF-ie-neo，該載體以精子介導法導入蠶卵，通過篩選并結合分子生物學鑒定，獲得了轉基

4、因家蠶。通過綠色熒光觀察結合采用10 mg/ml的G418篩選，PCR和點雜交鑒定，將IGF-Ⅰ轉基因家蠶系多代培養(yǎng)，選取G8代家蠶幼蟲解剖，取其后部絲腺制作凍干粉。ELISA檢測結果顯示G8代hIGF-Ⅰ在每克后部絲腺組織凍干粉中的表達水平為493 ng左右。通過尾部靜脈注射鏈脲霉素(STZ)建立糖尿病(DM)小鼠模型，用后部絲腺凍干粉對其灌胃，結果 DM小鼠血糖明顯下降(P<0.05)。表明轉基因家蠶絲腺表達hIGF-Ⅰ具有生物學活