大腸癌血清腫瘤標(biāo)記物平行檢測液相芯片的研制.pdf

1、結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，病因尚未十分明確。全球結(jié)直腸癌每年發(fā)病新病例數(shù)達(dá)94萬，每年近50萬人死于結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌死亡居癌癥死因第3位。結(jié)直腸癌在我國也是最常見的惡性腫瘤之一，目前居惡性腫瘤發(fā)病率第4位。目前早期發(fā)現(xiàn)及診斷結(jié)直腸癌的主要方法是纖維內(nèi)鏡檢查，大便潛血、直腸指檢與直腸鏡結(jié)合，以提高直腸癌的早期診斷率，但是目前還沒有一種更好的無創(chuàng)的早期診斷的血液診斷指標(biāo)。腫瘤標(biāo)記物作為結(jié)直腸癌的輔助診斷指標(biāo)已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但是需要逐

2、項(xiàng)去做，給臨床檢測帶來較多的麻煩，同時(shí)試驗(yàn)成本也高，因此非常有必要研究開發(fā)一種可以同時(shí)檢測多種腫瘤標(biāo)記物的診斷技術(shù)，2000年誕生的生物芯片技術(shù)之高通量、平行檢測的優(yōu)勢能滿足這一需要。 目的 本課題選用臨床上正在應(yīng)用的血清標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原199(CA199)、糖鏈抗原242(CA242)作為靶蛋白，采用一次可準(zhǔn)確可靠測定多種靶分子的Luminex多色微球檢測技術(shù)，研發(fā)可直接檢測結(jié)直腸癌的血清標(biāo)記物的液相

3、芯片檢測系統(tǒng)，即可做到正確的診斷結(jié)直腸癌，又能方便快捷，一次檢測多個(gè)標(biāo)記物，避免常規(guī)ELISA的繁瑣，和接觸有害物質(zhì)的弱點(diǎn)，節(jié)約成本。 方法 1．CEA、CA199、CA242配對抗體的選擇，包括用于結(jié)合腫瘤標(biāo)記物的捕獲抗體，和用于檢測腫瘤標(biāo)記物的濃度的檢測抗體，兩個(gè)抗體必須是識別待測腫瘤標(biāo)記物的不同位點(diǎn)。 2．微球的選擇：由于要檢測的目標(biāo)是蛋白質(zhì)，因此選擇羧基微球，可以與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而達(dá)到偶聯(lián)的目的。

4、 3．CEA、CA199、CA242檢測抗體的生物素化：按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行，偶聯(lián)后進(jìn)行透析及柱純化。 4．CEA、CA199、CA242的捕獲抗體與微球的偶聯(lián)：分別選用羧基微球5號、35號和79號，利用微球所含有的羧基分別與CEA捕獲抗體、CA199捕獲抗體和CA242捕獲抗體中的的蛋白質(zhì)分子中的氨基反應(yīng)形成共價(jià)偶聯(lián)，成為可捕獲目的蛋白的靶分子。 5．包被好的微球與血清反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：采用L<,9>(3<'4>

5、)正交法。 6．生物化的CEA、CA199、CA242檢測抗體反應(yīng)濃度以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：采用L<,9>(3<'4>)正交法。 7．SA-R-PE反應(yīng)濃度及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化采用L<,9>(3<'4>)正交法。 8．標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及可信限的確定：不同的標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)記物的濃度范圍不同根，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合情況，確定測量的可信限范圍。 9．Cutoff值的確定：通過查閱文獻(xiàn)以及正常人與病人的樣本的檢測確定

6、cutoff值，并進(jìn)行腫瘤標(biāo)記物液相芯片系統(tǒng)靈敏度、特異度評價(jià)。 10．芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)上述結(jié)果制備可同時(shí)檢測3種腫瘤標(biāo)記物的液相芯片，并對芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。 11．大腸癌腫瘤標(biāo)記物平行檢測液相芯片的應(yīng)用及其與傳統(tǒng)方法的比較及評價(jià)：應(yīng)用研制的液相芯片對55例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的檢測結(jié)果比較，SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件分析檢測結(jié)果。 結(jié)果 1． CEA、

7、CA199、CA242配對抗體的選擇配對抗體經(jīng)過查閱資料，選擇從公司購買，包括：CEA捕獲抗體、CEA檢測抗體；CA199捕獲抗體、CA199檢測抗體；CA242包被抗體、CA242檢測抗體。 2．羧基微球的選擇根據(jù)公司的推薦及查閱資料選擇5號、35號和79號微球 3．用ELISA的方法檢驗(yàn)生物素化的抗體，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，與商業(yè)化的抗體相比沒有統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4．微球包被好，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)微球的濃度，5號微球濃

8、度1.5×10<'6>個(gè)/ml，35號微球濃度1.1×10<'6>個(gè)/ml，79號微球濃度1.3×10<'6>個(gè)/ml。 5．標(biāo)記物的捕獲抗體與微球的偶聯(lián)效果：將包被好的微球運(yùn)用Luminex系統(tǒng)檢測偶聯(lián)效果： 包被CEA抗體的5號羧基微球平均熒光強(qiáng)度為18853.5，5號空白羧基微球平均熒光強(qiáng)度為82；包被CAl99抗體的35號羧基微球平均熒光強(qiáng)度為12500，35號空白羧基微球平均熒光強(qiáng)度為35；包被CA242抗體的

9、79號羧基微球平均熒光強(qiáng)度為17019.5，79號空白羧基微球平均熒光強(qiáng)度為75。 6．包被好的微球與血清反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)。 7．生物化的CEA、CA199、CA242抗體反應(yīng)濃度以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：最優(yōu)反應(yīng)濃度為1:300稀釋，最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)。 8． SA-R-PE反應(yīng)濃度及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：最優(yōu)反應(yīng)濃度為12μg/ml，最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間30分鐘。 9．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合情

10、況，確定測量CEA、CA199和CA242可信限范圍分別為150ng/ml、150U/ml和240U/ml。 10．通過查閱文獻(xiàn)以及樣本的檢測確定CEA、CA199和CA242cutoff值分別為8ng/ml、37U/ml和20U/ml。 芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述結(jié)果制備可同時(shí)檢測3種腫瘤標(biāo)記物的芯片，并對芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測：經(jīng)卡方檢驗(yàn)，對同一標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)檢測，結(jié)果無顯著性差異。最后優(yōu)化的條件為：

11、 ①待檢血清與500個(gè)包被好的微球反應(yīng)1小時(shí)。 ②洗滌3次，每次2min。 ③加入1:300稀釋好的生物素化的CEA、CA199和CA242檢測抗體，反應(yīng)1小時(shí)。 ④洗滌3次，每次2min。 ⑤按濃度12μg/ml加入SA-R-PE，反應(yīng)時(shí)間30min。 ⑥luminex100檢測：全程的實(shí)驗(yàn)時(shí)間大約2.5小時(shí)完成，大大的縮短了試驗(yàn)時(shí)間，較目前采用的方法簡便快速，而且有高通量的特點(diǎn)。 1

12、1．對55份臨床血清分別用液相芯片和ELISA方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 結(jié)論 建立了基于抗原抗體反應(yīng)的液相蛋白芯片系統(tǒng)，并且制備了能同時(shí)檢測3種大腸癌腫瘤標(biāo)記物的液相蛋白芯片，并優(yōu)化出了最佳反應(yīng)條件。將目前對腫瘤標(biāo)記物的單個(gè)檢測到多種標(biāo)記物的平行檢測的目的，具有樣本用量少、節(jié)約時(shí)間、操作簡便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。該方法具有較強(qiáng)的臨床檢測使用價(jià)值，為進(jìn)一步開發(fā)更多腫瘤標(biāo)記物平行檢測的