正常及再障模型小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干細胞之外的另一類干細胞。它具有極高的橫向分化和復(fù)制能力，在不同誘導(dǎo)條件下具有多向分化潛能。目前常用于培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法主要有全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度分離法。前者簡單易行，將骨髓全部接種，利用干細胞貼壁時間短，通過換液達到分離、純化的目的；后者是將淋巴細胞分離液分離出的單個核細胞接種。目前尚無一種標(biāo)志物能作為MSCs的身份特征

2、，國際上通常采用多種CD分子的組合綜合界定。MSCs是正常造血功能賴以存在和發(fā)揮功能的必要支持，因而在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景。本實驗以小鼠骨髓為MSC來源，旨在摸索有效、可行的骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)方法，對所培養(yǎng)的BMMSC進行鑒定，并檢測這種培養(yǎng)法的產(chǎn)率。 臨床上惡性血液病患者經(jīng)反復(fù)放、化療，常出現(xiàn)骨髓造血恢復(fù)延遲，有較長時間的低細胞期。研究表明：骨髓恢復(fù)延遲可能與骨髓基質(zhì)損傷有關(guān)。BMMSC是骨髓基質(zhì)的組成之

3、一，故我們利用小鼠研究BMMSC損傷時的分離、培養(yǎng)，并觀察此時小鼠BMMSC的狀況，為臨床治療方面提供新的思路。 方法： 1、動物：選用清潔級4～6周齡BALB/c(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)為骨髓細胞來源。清潔級4～6周齡DBA/2(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)為免疫細胞來源，飼養(yǎng)于無菌層流柜中。 2、MSC的分離和培養(yǎng) 全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法：將BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，超凈臺內(nèi)無菌分離

4、小鼠股骨及脛骨，以CCM(完全培養(yǎng)基，為F12-DMEM培養(yǎng)液，含青霉素100μg/ml、鏈霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)沖洗骨髓腔，輕柔吹打沖洗液，制成單細胞懸液，直接接種于25cm<'2>一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶中，為P0(Passage 0)代。每瓶培養(yǎng)基體積補足至5ml。細胞終濃度約為1×10<'8>/L，37℃，5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)。所用小鼠只數(shù)與接種瓶數(shù)比例為1∶1。 密度

5、梯度離心法：以同上方法獲得骨髓細胞，離心，用CCM重懸沉淀，緩慢加于Ficoll分離液(p=1.077g/ml)上，常溫離心(1500rpm，15min)，吸取界面層細胞，無菌PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌2次，以CCM調(diào)整細胞濃度至7～8×10<'6>L培養(yǎng)為PO’代。培養(yǎng)及傳代條件同前。 全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法72小時首次全量換液；密度梯度離心法72小時首次半量換液。此后根據(jù)細胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)基顏色等客觀條件，約每2～3天適時換液

6、。細胞逐漸貼壁、融合。當(dāng)細胞生長達到80～90％融合時，0.25％胰蛋白酶消化、傳代。第一代為P1，第二代為P2，以此類推。 每種方法組種植5瓶細胞，分別選取兩組生長好的不同代細胞，MTT法測定細胞活力，繪制生長曲線。 3、MSC的鑒定 3．1倒置顯微鏡下直接觀察活體細胞形態(tài)，適時留取照片； 3．2選取不同代數(shù)的MSC制作細胞爬片，瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及不同傳代數(shù)對其影響； 3．3選取抗

7、鼠CD34、CD414、CD45三種單抗，用流式細胞儀進行MSCs細胞免疫表型測定； 3．4誘導(dǎo)分化 3．4．1成骨分化誘導(dǎo)體系：地塞米松(10<'-7>mol/L)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/L)、維生素C(50mg/L)，以CCM為溶劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待細胞形態(tài)發(fā)生改變，可見鈣化結(jié)節(jié)時，ALP染色，證實分化效果。 3．4．2成脂分化誘導(dǎo)體系：地塞米松1μmol/L、胰島素10mg/L，以CC

8、M為溶劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)脂肪空泡時，油紅O染色，證實分化效果。 4、免疫介導(dǎo)再障模型小鼠的構(gòu)建，分三組進行： 單純照射組：BALB/c小鼠，lO只，雌雄各半，<'60>Co γ射線8Gy照射。 脾細胞組：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射線8Gy照射后4h內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠脾臟的單細胞懸液0.2ml(細胞數(shù)為1×10<'6>)。 假照

9、射組(對照組)：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射線8Gy照射時以鉛磚屏蔽，照射后4h內(nèi)由尾靜脈輸入0.2ml生理鹽水。 三組均于第7、15、30天行血常規(guī)檢查。 5、選取血象最低時及血象恢復(fù)后的存活小鼠，按第一部分中的全骨髓培養(yǎng)法，分離、培養(yǎng)小鼠BMMSCs，與來源于正常小鼠的BMMSC作對照。每日在倒置顯微鏡下觀察活體細胞形態(tài)，適時留取照片。MTT法繪制生長曲線。 6、統(tǒng)計學(xué)分析：血常規(guī)數(shù)

10、據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗各組間差異，方差不齊者改用非參數(shù)檢驗，取α=0.05。結(jié)果1在我實驗室條件下，全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法及梯度密度離心法均能成功地培養(yǎng)出BMMSCs。原代細胞生長曲線顯示前者細胞貼壁早，生長快，更早達到傳代規(guī)模。與后者比較有顯著差異。達到傳代規(guī)模時的培養(yǎng)天數(shù)均數(shù)為D<,P0>∶D<,P0>=9.6±1.14：14.2±1.48(p<0.05)。 MTT法測定細胞活力(貼壁率)：P0/P0’細胞第1～2天變化

11、不大，可能為細胞生長的潛伏適應(yīng)期；第3天后貼壁顯著增加，提示細胞進入對數(shù)生長期；第6天起增長緩慢，進入平臺期。從P2開始，傳代間隔逐漸縮短(P0要約14天，P1約10天，P2約1周，P3約3～4天)。從P4起，約消化傳代第2天，細胞就可以貼壁達到60～70％的融合。 2．MSC形態(tài)學(xué)觀察：急性分離的小鼠骨髓細胞接種4小時后，部分細胞貼壁，呈圓形。24小時后呈紡錘形、梭形、多角形等，形態(tài)多樣，部分細胞形成集落，增殖迅速，集落之間相

12、互靠近。達80～90％融合時細胞形態(tài)不規(guī)則，有梭形、星形、多角形等。胞體肥大，胞質(zhì)豐富。P3以后，融合后的細胞呈旋渦狀，細胞形態(tài)較前均一。 瑞-吉染色MSC形態(tài)觀察：P0～P2時，MSCs高倍鏡下細胞呈梭形、星形、多角形等，胞體肥大，胞質(zhì)豐富，有細長、分叉的突足，細胞核大而疏松，核仁明顯，可見到處于分裂相的核仁。P3以后細胞形態(tài)逐漸趨向均一，呈成纖維樣集落狀生長并相互融合。P7以后逐漸出現(xiàn)“旋渦”樣集落，細胞密度極大。

13、流式細胞學(xué)分析各期MSCs表面抗原：P0表面抗原表達譜為9.03％CD34，1.86％CD44，100％CD45，P3表面抗原表達譜為0.04％CD34，97.37％CD44，4.29％CD45。多向分化：成脂肪細胞及成骨細胞誘導(dǎo)體系可以誘導(dǎo)P3及以后的培養(yǎng)細胞分別分化為具有脂肪細胞和成骨細胞特點的細胞。 3脾細胞組小鼠于照射后第8天起陸續(xù)出現(xiàn)皮毛散亂、體重下降、蒼白萎靡。外周血象于照射后開始下降，持續(xù)減低15天以上。第7天白細

14、胞水平達到最低點，顯著低于正常。單純照射組小鼠血象在第15天已開始恢復(fù)。假照射組小鼠無上述變化。 脾細胞組第7、15天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，急性分離的骨髓單個核細胞計數(shù)明顯低于正常對照組，細胞形態(tài)基本與對照組無明顯區(qū)別。細胞接種后72小時后始有少量細胞貼壁，大部分細胞懸浮、死亡。貼壁細胞形態(tài)為圓形或多角形。生長曲線顯示其生長明顯慢于對照組。 鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)與對照組相比，脾細胞組MSCs集落形成慢，數(shù)量少，細胞

15、增殖緩慢。培養(yǎng)2周后，細胞融合不足50％，并且逐漸有細胞漂浮、死亡。培養(yǎng)3周，所剩細胞已不足20％，不能滿足傳代要求。脾細胞組第30天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，與對照組相比，無明顯差異。 結(jié)論 1、全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法較梯度密度離心法可以更有效地獲取小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞： 2、P3～P12 MSCs具有表型均一的特點和多向分化能力； 3、兩種方法所培養(yǎng)的細胞形態(tài)學(xué)、細胞表面免疫表型測定符合MSC特點，均