免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及定向分化的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)起源于中胚層,主要存在于哺乳動(dòng)物的骨髓中,與造血干細(xì)胞(Hemopoietic stem cells,HSCs)共存。BMSCs不僅參與構(gòu)建造血微環(huán)境,發(fā)揮支持造血的作用,而且易于體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增、可自體移植并具有跨胚層分化為多種細(xì)胞類型的能力,未分化的或經(jīng)遺傳修飾過(guò)的BMSCs有望成為未來(lái)細(xì)胞/基因治療、組織工程的理想種子細(xì)胞。

2、>　　 本研究目的在于闡明兔BMSCs的生物學(xué)特性,優(yōu)化兔BMSCs的增殖培養(yǎng)條件,并研究其分化為脂肪細(xì)胞的潛能,以便未來(lái)利用該類細(xì)胞作為疾病細(xì)胞和基因治療的模型。為此,本試驗(yàn)利用一月齡日本大白兔為對(duì)象,較為系統(tǒng)全面地研究了其BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定、形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性及體外誘導(dǎo)分化能力,為進(jìn)一步深入研究BMSCs的誘導(dǎo)分化和應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 1.本試驗(yàn)應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液法,根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)

3、的特點(diǎn),成功分離得到兔股骨和脛骨MSCs,體外培養(yǎng)至第7代。本試驗(yàn)所分離的兔BMSCs,增殖能力強(qiáng),體外適應(yīng)性較好,通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、測(cè)定24h貼壁率得出,隨著傳代次數(shù)的增多,增殖能力下降,貼壁時(shí)間延長(zhǎng),選用前4代傳代細(xì)胞作為進(jìn)一步的研究對(duì)象最為合適；經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)得出兔BMSCs表面標(biāo)志CD90、CD44陽(yáng)性表達(dá),CD34陰性,可初步鑒定所分離的細(xì)胞為兔BMSCs,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 2.本試驗(yàn)通過(guò)四甲基偶氮唑

4、鹽比色法(MTT法)比較不同培養(yǎng)基及血清濃度對(duì)兔BMSCs生K的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不加血清時(shí),細(xì)胞在LG—DMEM和DMEM/F12中的生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯并差異(P>0.05),加血清后,細(xì)胞在DMEM/F12中的生長(zhǎng)速度均比在LG—DMEM中的生長(zhǎng)速度快(P<0.05),其中兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在DMEM/F12+20％FBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快。另外,在LG—DMEM+10％FBS培養(yǎng)液中添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),通過(guò)MTT法來(lái)

5、檢測(cè)bFGF對(duì)體外培養(yǎng)的兔骨髓MSCs增殖的影響,結(jié)果表明,bFGF具有促進(jìn)體外培養(yǎng)的兔BMSCs增殖的作用,其促增殖效應(yīng)與其質(zhì)量濃度關(guān)系密切:5～20μg/L效應(yīng)不明顯(P>0.05),在40～100μ g/L時(shí)促增殖效應(yīng)顯并(P<0.05),在80μ g/L時(shí)其促增殖效應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期分析bFGF促進(jìn)兔BMSCs增殖的機(jī)理,結(jié)果表明,添加bFGF組的細(xì)胞中處于S+G2/M期(增殖指數(shù))的細(xì)胞百分率為(32.8