人脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外向黑素細胞定向分化的研究.pdf

1、目的:建立體外分離培養(yǎng)獲得人脂肪間充質干細胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells，hADSCs)的方法，并對其形態(tài)、免疫表型、生物學特性進行觀察和研究;建立體外誘導hADSCs分化為黑素細胞的方法。
　　 方法:
　　 1、剖腹產手術獲得腹部皮下脂肪，0.15％Ⅰ型膠原酶消化法獲得人脂肪間充質干細胞行體外培養(yǎng)。用MTT細胞增殖試驗繪制增殖曲線，用流式細胞檢測細胞周期，用流式細

2、胞及細胞免疫熒光技術檢測細胞表面抗原，用成骨成脂分化鑒定其多向分化潛能。
　　 2、通過將SCF、EDN3、bFGF等添加到條件培養(yǎng)基中，體外誘導第5代hADSCs向黑素細胞分化，誘導至第10周。使用qRT-PCR檢測黑素相關基因MITF，KIT，DCT，TYR，TYRP1，SOX10mRNA的表達水平。誘導結束后，通過多巴染色、免疫細胞化學法、細胞免疫熒光法進行鑒定。
　　 結果:
　　 1、hADSCs的分離

3、、培養(yǎng)和鑒定:
　　 (1)通過分離培養(yǎng)，獲得了大量旋渦狀生長的成纖維樣hADSCs。
　　 (2)MTT法顯示細胞增殖能力強。
　　 (3)細胞周期檢測顯示:第3代hADSCs90.76％處于G0～G1期，9.24％的細胞處于S+G2期;第10代hADSCs仍有88.63％處于G0～G1期，11.37％的細胞處于S+G2期。表明體外培養(yǎng)的hADSCs具有穩(wěn)定的增殖能力。
　　 (4)流式鑒定結果示:CD

4、29+、CD31-、CD34-、CD45-、CD73+、CD105+、CD166+、HLA-DR-。
　　 (5)細胞免疫熒光結果與流式細胞檢測高表達的結果一致。
　　 (6)hADSCs在特定誘導條件下，具有向骨細胞和脂肪細胞分化的潛能。qRT-PCR結果顯示:成骨成脂相關基因OPN及PPARγ-2各有時間依賴遞增表達，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 (7)在成骨分化過程中，發(fā)現(xiàn)同時伴有成脂發(fā)生。與對照

5、組相比，成骨誘導組PPARγ-2mRNA有時間依賴性遞增表達，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 2、體外誘導hADSCs向黑素細胞分化:
　　 (1)分化過程中，光鏡下細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)殡p極化、多極化為主的類黑素細胞樹突狀結構。
　　 (2)在10周的誘導過程中，qRT-PCR結果顯示，黑素相關基因MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10mRNA的表達升高，與正常對照組比較，t值分別為

6、16.34、22.93、13.03、25.63、14.02、9.24(P＜0.01)。
　　 (3)誘導結束后，多巴染色誘導組呈陽性，對照組陰性。
　　 (4)誘導結束后，免疫細胞化學誘導組MITF、HMB45染色均陽性，正常對照組分別為弱陽性和陰性。
　　 (5)細胞免疫熒光TYRP1，S100誘導組陽性表達，對照組陰性表達。
　　 結論:
　　 1、建立了一個高效分離培養(yǎng)hADSCs的方法，所