成肌細(xì)胞促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究采用與成肌細(xì)胞共同培養(yǎng)的方式，模擬體內(nèi)的成肌微環(huán)境，促進(jìn)MSCs的成肌分化及其移植效率的提高。通過(guò)移植共同培養(yǎng)后的細(xì)胞，尋找提高M(jìn)SCs移植效率的新途徑，為將來(lái)的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)，初步研究在共同培養(yǎng)條件下，成肌細(xì)胞促進(jìn)MSCs成肌性分化的可能機(jī)制。 1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠作為MSCs供體鼠，正常野生型C57鼠作為正常對(duì)照，未經(jīng)移植的mdx鼠作為陰性對(duì)照，將mdx鼠下肢肌肉(脛前肌和腓腸肌)的左右側(cè)分

2、別作為共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞局部注射移植處。選取6-8周齡的mdx鼠進(jìn)行移植，分別于移植后2、4、8、12和16周取材。在細(xì)胞移植過(guò)程中死亡的mdx鼠退出試驗(yàn)，保持各組和各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物為3只左右。 1.2MSCs、HEK293細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞的培養(yǎng)取SD大鼠骨髓做原代培養(yǎng)，再用差速貼壁法分離、擴(kuò)增及純化MSCs，再用流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行表面抗原鑒定，將形態(tài)一致的P4-6代MSCs用于移植。當(dāng)293細(xì)胞生長(zhǎng)至70～8

3、0％融合時(shí)，可用于Ad-eGFP的擴(kuò)增。C2C12成肌細(xì)胞生長(zhǎng)至70～80％融合時(shí)，可傳代或用于共同培養(yǎng)。 1.3Ad-eGFP的擴(kuò)增、純化、鑒定和轉(zhuǎn)染 當(dāng)接種過(guò)構(gòu)建有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)的293細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)(CPE)后，可以收獲病毒。用CsCl2梯度離心法純化病毒，用TCID50檢測(cè)方法測(cè)定病毒滴度。提取病毒DNA，進(jìn)行E2b區(qū)的PCR檢測(cè)。按照感染復(fù)數(shù)的不同分別接種相應(yīng)劑量的Ad-eGFP，

4、用FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 1.4MSCs和C2C12成肌細(xì)胞的共同培養(yǎng) 將轉(zhuǎn)染eGFP后的MSCs與C2C12成肌細(xì)胞按照10∶1的比例接種，用含有2％馬血清的DMEM培養(yǎng)。 1.5誘導(dǎo)分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測(cè) 分別選取誘導(dǎo)分化后第1、3、5和7天的共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞，做MyoD和Myogenin表達(dá)的RT-PCR、WesternBlot和

5、免疫熒光檢測(cè)，并比較兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 1.6誘導(dǎo)分化后MSCs胞漿中鈣離子濃度變化的激光共聚焦檢測(cè)分別選取誘導(dǎo)分化后48h的共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組的MSCs，用Fluo3標(biāo)記鈣離子，用激光共聚焦顯微鏡先掃描得到基線熒光強(qiáng)度之后，再添加nicotine，繼續(xù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。 1.7將mdx鼠預(yù)先放療后進(jìn)行局部肌肉注射性的細(xì)胞移植首先預(yù)先放療mdx鼠，再將共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞分別多點(diǎn)注射注射到mdx鼠的

6、單側(cè)肌肉(脛前肌和腓腸肌)，注射總量為0.4ml，移植細(xì)胞總數(shù)約為1×106個(gè)。 1.8肌肉組織HE染色分別選取移植后2，4，8，12和16周的共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組肌肉的冰凍切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)算細(xì)胞核中心移位肌纖維的比例。 1.9移植后肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子和相關(guān)蛋白表達(dá)的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測(cè) 分別選取移植共同培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞后第2、4、8、12和16

7、周的肌肉，進(jìn)行成肌調(diào)節(jié)因子和相關(guān)蛋白表達(dá)的RT-PCR、WesternBlot和免疫熒光檢測(cè)，并比較兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0進(jìn)行分析，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義的水平為P＜0.05。 2.結(jié)果2.1MSCs、HEK293細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特點(diǎn)MSCs為貼壁性的細(xì)胞，經(jīng)傳代3代以上趨于純化，多數(shù)呈均一典型的紡錘狀成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)FCM檢測(cè)，其中CD

8、11b和CD45表達(dá)陰性，而CD29和CD44表達(dá)陽(yáng)性。HEK293細(xì)胞呈現(xiàn)出上皮樣貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)迅速。C2C12成肌細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，在使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基以后，生長(zhǎng)減慢，開(kāi)始分化，并表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子。 2.2Ad-eGFP擴(kuò)增、鑒定并轉(zhuǎn)染MSCsAd-eGFP在轉(zhuǎn)染293細(xì)胞36-48h出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為：90％以上的細(xì)胞腫脹變圓并離散，部分聚集呈葡萄狀，10～20％的細(xì)胞漂浮。提取病毒DNA，進(jìn)行E2b區(qū)的PCR鑒

9、定，得到一條861bp的產(chǎn)物，提示腺病毒結(jié)構(gòu)完整。當(dāng)MOI分別為10、20、50、100、150、200、300、400和500的時(shí)候，經(jīng)FCM檢測(cè)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)染率依次為48.7、64.8、72.1、89.1、89.9、93.1、94.4、95.8和96.8(％)，MOI從10-100時(shí)候，轉(zhuǎn)染率增加最顯著，隨后盡管大幅度增加病毒的劑量，但其轉(zhuǎn)染效率不再明顯增加，同時(shí)細(xì)胞病變明顯，脫落細(xì)胞增多，因此在本研究中，以100作為最佳的MOI來(lái)感

10、染MSCs。在轉(zhuǎn)染24h后，eGFP的表達(dá)最為穩(wěn)定。 2.3誘導(dǎo)分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)在共同培養(yǎng)組中，MyoD于第3天表達(dá)量最高，在單獨(dú)培養(yǎng)組中，于第1和第3天表達(dá)量相對(duì)較高。兩組均在第5天時(shí)顯著下降，至第7天時(shí)僅有少量表達(dá)。在兩組細(xì)胞中，Myogenin的表達(dá)量在第1和第3天都很少，在第5天顯著提高，在第7天時(shí)下降。兩組之間表達(dá)量的差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 2.4誘導(dǎo)分化后MSCs中成肌

11、調(diào)節(jié)因子表達(dá)的WesternBlot檢測(cè)在兩組中，MyoD的表達(dá)均于第3和第5天達(dá)到高峰。Myogenin的表達(dá)均于第1天開(kāi)始就逐漸升高，在第5和第7天時(shí)達(dá)到高峰。兩組之間表達(dá)量的差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 2.5誘導(dǎo)分化后MSCs中成肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)將兩組MSCs誘導(dǎo)分化至第3天，分別計(jì)算MyoD和Myogenin表達(dá)的陽(yáng)性率。前者在共同培養(yǎng)組為11.8％，單獨(dú)培養(yǎng)組為2.7％。后者在共同培養(yǎng)組5.4％，單獨(dú)培養(yǎng)

12、組為3.3％。 2.6誘導(dǎo)分化后MSCs胞漿中鈣離子濃度變化的激光共聚焦檢測(cè)在先后加入10μl和50μl濃度為1M煙堿后，兩組細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記鈣離子的熒光信號(hào)強(qiáng)度開(kāi)始不同程度的升高(但也有個(gè)別細(xì)胞表現(xiàn)為下降)，然后呈現(xiàn)為緩慢下降的趨勢(shì)。其中在加入10μl的時(shí)候，熒光信號(hào)強(qiáng)度在兩組之間的差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。而在第2次加50μl的煙堿后，上述差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。2.7肌肉的組織病理 正常C57鼠肌肉細(xì)胞呈多角形，形

13、態(tài)基本一致，輪廓清晰、完整，肌細(xì)胞核位于細(xì)胞周邊，未見(jiàn)有胞核中移現(xiàn)象，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肌纖維間隙正常，肌內(nèi)束、肌間束結(jié)構(gòu)完整。在移植后mdx鼠的肌肉中，均有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞橫截面積大小不一，有萎縮和肥大細(xì)胞，肌細(xì)胞失去多角形形態(tài)，變成圓形，脂肪和纖維組織浸潤(rùn)不明顯，而肌細(xì)胞核中心移位明顯，但同時(shí)有少量的新生肌纖維的再生。未治療組mdx鼠CNF可達(dá)60％，在移植后2、4、8、12和16周后，共同培養(yǎng)組分別為56.7、52.1、5

14、0.3、45.6和41.6(％)，而單獨(dú)培養(yǎng)組分別為57.1、55.6、52.1、50.3和45.5(％)。 2.8移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)在mdx鼠中有MyoD和Myogenin的少量表達(dá)，二者隨著移植時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增多，在移植后第8周表達(dá)量最高，然后緩慢下降。兩組之間的差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 2.9移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)的WesternBlot檢測(cè)MyoD和Myo

15、genin的表達(dá)均隨移植時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多，前者在移植后第8周，后者在第12周表達(dá)量最多，16周時(shí)仍持續(xù)表達(dá)。兩組之間的差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 2.10移植后mdx鼠肌肉中成肌調(diào)節(jié)因子及相關(guān)蛋白表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)MyoD在正常C57鼠中沒(méi)有表達(dá)，未治療mdx鼠的陽(yáng)性率為5％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為6、12、20、15和10(％)，單獨(dú)培養(yǎng)組分別為6、10、15、12和8(％)。Myogenin

16、在正常C57鼠沒(méi)有表達(dá)，未治療mdx鼠的陽(yáng)性率為7％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為8、15、23、18和15(％)，單獨(dú)培養(yǎng)組分別為7、10、18、15和10(％)。MHC在正常C57鼠肌細(xì)胞無(wú)表達(dá)，未治療mdx鼠的陽(yáng)性細(xì)胞比例小于1％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為5、15、18、23和20(％)，單獨(dú)培養(yǎng)組分別為3、10、15、18和15(％)。mdx鼠肌肉細(xì)胞膜上基本無(wú)dystroph

17、in表達(dá)；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培養(yǎng)組分別為3、5、9、13和17(％)，單獨(dú)培養(yǎng)組分別為2、4、7、12和15(％)。 3.結(jié)論3.1構(gòu)建有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的腺病毒可以有效轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在后者的成肌分化過(guò)程中起到示蹤的作用。 3.2與成肌細(xì)胞共同培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以高效表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子；提示共同培養(yǎng)中的成肌細(xì)胞可以在一定程度上構(gòu)建成肌微環(huán)境，加速骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化。 3