骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化心臟瓣膜構(gòu)成細胞的實驗研究.pdf

1、目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度內(nèi)皮細胞的簡便方法,并對獲得細胞進行形態(tài)觀察及表面標志鑒定。
　　 材料和方法:1.取4周齡SD大鼠,雌雄不拘,無菌條件下提取原代骨髓間充質(zhì)干細胞,體外通過全髓貼壁法培養(yǎng)、純化、擴增,將獲得的P3-BMSCs采用流式細胞術(shù)進行細胞表面抗原鑒定,應(yīng)用的抗體為CD29和CD34。2.取P3-BMSCs分為2組:實驗組和對照組；實驗組細胞在L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)條

2、件下培養(yǎng)14d；對照組細胞以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,培養(yǎng)到7d和14d時取實驗組和對照組細胞爬片,用Anti-FactorⅧ進行免疫細胞化學鑒定。
　　 結(jié)果:1.通過全髓貼壁法可獲得均質(zhì)性較好的細胞,獲得的細胞培養(yǎng)到第3代時經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),細胞表達CD29的陽性率超過96％,而不表達CD34；BMSCs為均一的長梭形,漩渦狀、團簇狀生長,在體外增殖

3、能力強。2.實驗組P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細胞逐漸變的粗大,10d左右倒置顯微鏡下出現(xiàn)明顯的“鵝卵石”樣形態(tài),而對照組仍為均一的長梭形,漩渦狀、團簇狀生長,細胞形態(tài)無明顯變化；用免疫細胞化學技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)7d和14d的細胞表達Anti-FactorⅧ的陽性率分別為8296和93％,而對照組細胞陰性表達.Anti-FactorⅧ。
　　 結(jié)論:通過全髓貼壁法可獲得數(shù)量

4、足夠的、均質(zhì)的骨髓間充質(zhì)干細胞；BMSCs在L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為內(nèi)皮細胞,通過此法可在體外獲得大量高純度的內(nèi)皮細胞。
　　 目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度平滑肌細胞的簡便方法,并對獲得細胞進行形態(tài)觀察及表面標志鑒定。
　　 材料和方法:實驗組細胞P3-BMSCs在L-DMEM(20％FBS+2ng/ml:PDGF-BB)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)14d；對照組P3-

5、BMSCs以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,培養(yǎng)7d和14d時取實驗組和對照組細胞爬片,分別用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin進行免疫細胞化學鑒定。
　　 結(jié)果:P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+2ng/ml PDGF-BB)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細胞體積逐漸變大,呈不規(guī)則梭形,密集與稀疏相交錯,形成“峰一谷”狀形態(tài),而對照組仍為均一的

6、長梭形,漩渦狀、團簇狀生長,細胞形態(tài)無明顯變化；分別應(yīng)用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin進行免疫細胞化學檢測,結(jié)果顯示:7d和14d時實驗組細胞表達Anti-Actin alpha的陽性率分別為78％和87％,而Anti-Vimentin表達為陰性；對照組細胞對.Anti-Actin alpha和Anti-vimentin均呈陰性表達。
　　 結(jié)論:BMSCs在L-DMEM(20％FBS+2ng/ml

7、 PDGF-BB)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為平滑肌細胞,通過此法可在體外獲得大量高純度的平滑肌細胞。
　　 目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度成纖維細胞的簡便方法,并對獲得細胞進行形態(tài)觀察及表面標志鑒定。
　　 材料和方法:實驗組細胞P3-BMSCs在L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)14d,對照組P3-BMSCs以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；

8、每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,培養(yǎng)7d和14d時取實驗組和對照組細胞爬片,分別用Anti-Actin alpha.、Anti-Vimentin進行免疫細胞化學鑒定。
　　 結(jié)果:P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細胞逐漸變得細長,紡錘形,呈束狀、網(wǎng)狀排列生長,而對照組仍為均一的長梭形,漩渦狀、團簇狀生長,細胞形態(tài)無明顯變化；分別應(yīng)用Anti-Actin alpha、.An

9、ti-Vimentin進行免疫細胞化學鑒定,結(jié)果顯示:實驗組細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7d和14d時,細胞表達Anti-Actin alpha的陽性率分別為72％和82％,表達Anti-Vimentin的陽性率分別為75％和85％；而對照組細胞對Anti-Vimentin和對Anti-Actin alpha均呈陰性表達。
　　 結(jié)論:BMSCs在L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為成纖維細胞,通過此