柑橘生長素響應因子ARF基因家族的表達分析及功能驗證.pdf

1、生長素響應因子Auxin Response Factors（ARFs）在生長素信號轉導途徑中起著關鍵的作用，同時也參與了植物體內眾多的生理生化過程。ARFs基因所編碼的蛋白質可以與生長素響應基因啟動子中特定的響應元件結合，從而調節(jié)植物的各個生長發(fā)育過程。本文旨在運用分子生物學手段系統(tǒng)性地分析柑橘中的ARFs基因家族的特征，并對一些關鍵基因進行功能分析。主要結果如下:
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)并證實了柑橘（甜橙）中共有19個不同的ARF基

2、因，分別命名為CiARF1-CiARF19。該家族基因編碼的蛋白質都具有非常典型的特征，包含三個不同的結構域:分別為氨基末端DNA結合結構域（DNA BindingDomain，DBD）、中間結構域(Middle Region，MR)、羧基末端的AUX/IAA結合結構域（C-terminal Domain，CTD）。本研究通過對柑橘中的ARF基因家族進行系統(tǒng)進化分析、染色體定位分析、編碼蛋白的保守motif分析以及基因啟動子區(qū)的順式作用

3、元件分析，從而更加全面地解析了柑橘中ARF基因家族的特征。
　　2.通過定量PCR表達分析發(fā)現(xiàn)，CiARF在甜橙不同的組織和不同的發(fā)育階段，表現(xiàn)出不同的表達模式。一些基因在特定的組織和器官中特異性表達:總體來看，在營養(yǎng)器官中高量表達，在生殖器官中表達量相對較低。同時利用不同濃度的吲哚乙酸（IAA）和萘基鄰氨甲酰苯甲酸(NPA)處理伏令夏橙的愈傷組織，實驗結果表明，受局部高濃度IAA影響，處理6h后，CiARF1/3/4/6/8/1

4、5/16/17表達量降低，隨后有回升現(xiàn)象。5μmol/L和10μmol/L的NPA處理對CiARFs抑制作用較強。證明不同的CiARF基因對不同濃度的IAA和NPA的響應程度有所不同。
　　3.探索CRISPR-Cas9系統(tǒng)對CiARF8的修飾情況。構建CRISPR-Cas9載體并且轉化柑橘愈傷組織。經(jīng)轉化的愈傷組織的CiARF8序列與未轉化的沒有差別，說明在本試驗中CRISPR-Cas9系統(tǒng)沒有對CiARF8修飾成功。