羥基喜樹堿腦植入緩釋片的神經毒性研究.pdf

1、背景:羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin,HCPT)是從珙桐科植物喜樹(Camptothecaacuminata Decne)中提取得到的一種吲哚類生物堿,具有廣泛的抗腫瘤活性,且與其它抗腫瘤藥物無交叉耐藥性。HCPT可選擇性抑制拓樸異構酶而干擾DNA的復制,為拓撲異構酶Ⅰ特異性抑制劑。HCPT的抗癌作用與抗代謝藥及烷化藥不同,HCPT作用于S期細胞,為細胞周期性特異藥物。對S期的作用較G1,G2期明顯,對G0期細胞無作

2、用。在較高濃度時對核分裂有抑制作用,阻止細胞進入分裂期。
　　 腦膠質瘤(Glioma)是神經外科難治性疾病之一,術后常易復發(fā),因此術后化療成為腦膠質瘤輔助治療的重要手段。由于血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的存在,多數化療藥物常規(guī)靜脈給藥后,難以在腦內達到有效濃度,若加大給藥量又會導致全身性毒副作用的增加。近年來,間質化療在腦膠質瘤治療領域引起了廣泛的關注,已成為腦膠質瘤治療的重要手段。腦植入劑作為腦

3、部間質化療的一種新型制劑,不僅可以使化療藥物避開血腦屏障,直接作用于腫瘤組織,減少對正常組織的毒副作用,還具有緩控釋特性,使藥物能夠在病變部位較長時間維持在有效治療濃度,取得了較好的臨床效果。
　　 本課題組前期采用聚乳酸(polylactic acid,PLA)為緩釋材料,研制了HCPT腦內植入緩釋片,并對其治療大鼠實驗腦膠質瘤的療效進行了研究,顯示HCPT緩釋片腦內植入治療能明顯延長荷瘤大鼠的生存期。但HCPT腦內植入緩釋片

4、植于腦內后,在抑制腫瘤細胞增殖的同時,對大鼠的毒性的大小,特別是對腦組織的損傷程度是決定是否對該制劑進一步研究的重要因素,本實驗擬對HCPT腦內植入緩釋片的毒性進行研究,為該制劑進一步開發(fā)奠定基礎。
　　 實驗目的:
　　 (1)探討大鼠大腦皮層神經細胞的體外培養(yǎng)方法,并對其形態(tài)學進行觀察;
　　 (2)HCPT緩釋片對體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經細胞進行干預,觀察是否具有細胞毒性作用;
　　 (3)在體考察

5、HCPT緩釋片對大鼠大腦組織結構和功能的損傷:
　　 (4)在體考察HCPT緩釋片對大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺以及腎臟組織的損傷;
　　 (5)在體考察HCPT緩釋片對大鼠骨髓的抑制作用。
　　 (6)在體考察HCPT緩釋片對胎鼠的致畸毒副作用及對胎鼠腦組織結構的影響。
　　 實驗方法:
　　 (1)取新生SD乳大鼠的大腦皮層組織,采用胰酶消化、篩網過濾、離心等技術獲取大腦皮層神經細胞并進行培養(yǎng);<

6、br>　　 (2)通過倒置顯微鏡、免疫細胞化學等方法對SD乳大鼠大腦皮層神經細胞進行定性和定量鑒定;
　　 (3)采用CCK-8檢測HCPT對體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經細胞的毒性;
　　 (4)采用Hoechst33258染色檢測HCPT致體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經細胞凋亡的程度;
　　 (5)將不同劑量的HCPT緩釋片植入大鼠腦內,分別取30d和120d的實驗大鼠,灌注后,取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺以及腎臟組織,

7、通過石蠟切片、HE染色觀察各組織的形態(tài)結構變化:
　　 (6)分別對術后30d和120d實驗大鼠腦組織標本進行Nissl染色,觀察神經元胞漿內尼氏體的數量,評價神經元蛋白合成的能力;
　　 (7)分別對術后30d和120d實驗大鼠腦組織標本進行TUNEL染色,觀察受損腦組織神經元的凋亡比例;
　　 (8)取術后30d大鼠股骨骨髓,涂片后進行瑞氏染色(wright's stain),觀察有核細胞的比例。
　　

8、 (9)將HCPT緩釋片植入孕鼠腦內,在分娩1d時取孕大鼠及胎鼠腦組織,通過神經元體外原代培養(yǎng)、HE染色觀察腦組織神經元的形態(tài)結構變化;
　　 實驗結果:
　　 (1)經形態(tài)學、免疫細胞化學(NSE)鑒定所培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經元并鑒定其純度大于95％;
　　 (2)CCK-8檢測結果顯示,①PLA對體外原代培養(yǎng)的大腦皮層神經元和星形膠質細胞生長影響不明顯;②體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經元經以40μg/ml

9、HCPT處理24h后,與正常對照組比較,細胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達到320μg/ml時,降低程度十分顯著(P＜0.01):③體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質細胞經20μg/ml HCPT處理24h后,與正常對照組比較,細胞活性顯著降低(P＜0.05);濃度達到80μg/ml時,降低程度十分顯著(P＜0.01);④體外模擬HCPT緩釋片處理神經細胞較單獨使用HCPT,對細胞的毒性更明顯。
　　 (3)Hoe

10、chst33258染色結果顯示,①PLA致體外原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經元和星形膠質細胞凋亡不明顯;②體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經元經80μg/ml HCPT處理24h后,與正常對照組比較,細胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達到160μg/ml時,降低程度十分顯著(P＜0.01):③體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦星形膠質細胞經40μg/mlHCPT處理24h后,與正常對照組比較,細胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達到80

11、μg/ml時,降低程度十分顯著(P＜0.05);④體外模擬HCPT堿緩釋片處理神經細胞較單獨使用HCPT,細胞凋亡比例無顯著差異。
　　 (4)經大鼠體內實驗,大腦皮層組織免疫組化染色結果顯示,PLA對皮層組織神經細胞的數量和活性沒有顯著的影響;HCPT緩釋片對皮層組織神經細胞的數量和活性有一定的影響;低劑量HCPT緩釋片植入大腦皮層后,與假手術組比較,腦組織未見病理學改變;高劑量HCPT緩釋片對大腦皮層組織神經元的數量和活性具

12、有顯著影響。
　　 (5)經大鼠體內實驗,HE染色顯示,高劑量HCPT緩釋片對肝臟具有一定的損傷,出現肝水腫,而心臟、脾臟、肺以及腎臟組織未見病理學改變。
　　 (6)經大鼠體內實驗,瑞氏染色顯示,未見HCPT緩釋片骨髓抑制。
　　 (7)經神經元體外原代培養(yǎng),模型組胎鼠神經元體外發(fā)育良好,與正常對照組比較未見形態(tài)學差異;經大鼠體內實驗,HE染色顯示,模型孕鼠腦組織有一定的炎癥反應,而胎鼠腦組織未見病理學改變。<

13、br>　　 結論:(1)采用無血清培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)出了數量多、純度高的大腦皮層神經元;(2)PI。A對體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質細胞和大鼠大腦皮層神經元毒性作用不顯著。(3)HCPT對體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質細胞和大鼠大腦皮層神經元均表現出一定的毒性作用,且對大鼠大腦皮層星形膠質細胞的毒性強于對大鼠大腦皮層神經元的毒性;
　　 (4)經大鼠體內實驗,PLA空白片對腦組織結構和功能的損傷不顯著;