宮內生長遲緩和生后高蛋白飲食干預對大鼠腎臟蛋白質表達譜的影響.pdf

1、宮內生長遲緩(intratrterine growth restriction,IUGR)可通過“胎兒程序化”途徑對機體各器官功能產生長期以至終生的影響,與成年期嚴重危害人類健康的許多疾病如高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎臟病等均有一定的關系。有關IUGR與腎臟疾病關系的人類研究發(fā)現(xiàn),IUGR胎兒腎臟體積較正常胎兒明顯縮小同時腎小球數(shù)目明顯減少,而生后的長期隨訪發(fā)現(xiàn),IUGR組腎小球濾過功能較正常組明顯降低而蛋白尿發(fā)生率明顯增高。而我科以

2、往動物實驗的資料又表明,IUGR大鼠出生時腎小球數(shù)目明顯減少,同時伴有皮質區(qū)變薄和生腎區(qū)增厚,且生后隨訪中蛋白尿和高血壓的發(fā)生率明顯增高。但目前有關IUGR引起出生時腎小球數(shù)目減少、腎臟發(fā)育異常以及生后腎臟疾病的確切發(fā)病機制仍未完全闡明。
　　以往認為,生后早期的營養(yǎng)干預尤其是高蛋白飲食對IUGR患兒體格的快速增長具有一定的幫助。但近來有人提出了“預計的適應性改變”(predictiveadaptive response,PAR)

3、的理論:胎兒可根據(jù)發(fā)育階段的環(huán)境而對生后環(huán)境進行預計,引發(fā)一系列的適應性改變。研究顯示,宮內營養(yǎng)不良的仔鼠如果生后飲食越豐富,其壽命越短,而我科前期有關IUGR新生仔鼠生后高蛋白飲食干預的研究發(fā)現(xiàn),高蛋白飲食不僅不能糾正生后腎小球數(shù)目的減少,反而加重了高血壓和蛋白尿的嚴重程度,但目前有關IUGR生后高蛋白飲食干預對腎臟影響的可能機理仍未完全闡明。
　　近年來,蛋白質組學技術在醫(yī)學基礎研究領域得到了廣泛應用,它可以整體、定量、動態(tài)地

4、研究組織或細胞中蛋白質譜的變化,以及與疾病發(fā)生發(fā)展不同階段的關系,在疾病機制的研究和尋找新的藥物治療靶點中具有重要意義。因此,本課題通過蛋白質組學方法研究IUGR新生鼠與正常新生鼠腎臟蛋白質表達譜的差異、IUGR成年鼠與正常成年鼠腎臟蛋白質表達譜的差異以及生后高蛋白飲食干預對腎臟蛋白質表達譜的影響,并進一步進行驗證,以探討IUGR大鼠腎臟發(fā)育異常的可能機制、IUGR生后腎臟損害相關的關鍵蛋白分子及高蛋白飲食干預對腎臟影響的可能機理。

5、r>　　為研究IUGR新生鼠與正常新生鼠腎臟蛋白質表達譜的差異,采用孕期全程低蛋白飲食法(6％低蛋白等熱卡飼料)建立IUGR大鼠模型,選擇新生鼠仔出生體重在正常對照組平均體重-2SD以下者為IUGR組。對照組以孕期常規(guī)飼料(含22％蛋白質)飼養(yǎng)至自然分娩,所生新生鼠仔作為正常對照組。8個IUGR組腎臟(平均腎重48mg±3mg,總腎重385mg)和6個正常對照組腎臟(平均腎重64mg±4mg,總腎重383mg)分別混合后抽提總蛋白,雙向

6、凝膠電泳后使用雙胺銀染法染色,凝膠圖像分析后切取組問差異明顯的蛋白質點通過質譜儀進行肽指紋譜和串級質譜鑒定。差異表達分析及質譜鑒定共篩選出僅在IUGR組表達的蛋白11個(包括非特異性二肽酶、甲基丙二酸半醛脫氫酶、轉酮醇酶、尿嘧啶核苷磷酸合成酶、波形蛋白、載脂蛋白A-Ⅳ、細胞角蛋白10、26S蛋白酶調節(jié)亞基7、δ-1-吡咯啉-5-羧化脫氫酶、視黃醇脫氫酶1、Rho GDP解離抑制因子α等),僅在正常對照組表達的蛋白1個(即剪接因子精氨酸/

7、絲氨酸豐富9);IUGR組較正常對照組表達大于5倍的蛋白7個(包括尿卟啉原脫羧酶、異質性胞核核糖核蛋白K、75kDa葡萄糖調節(jié)蛋白、227kDa紡錘體-著絲點相關蛋白、二硫化物異構酶A3、細胞分裂蛋白激酶2、α電子轉運黃素蛋白等),正常對照組較IUGR組表達大于5倍的蛋白2個(即γ-肌動蛋白和串珠素)。這些差異蛋白質主要參與能量代謝、氧化還原、信號轉導以及細胞增殖和凋亡等過程,其中結構分子有4個,包括波形蛋白、串珠素、γ-肌動蛋白和細胞

8、角蛋白10。對波形蛋白和串珠素進一步通過western blot和免疫組化方法在腎臟組織中對其差異表達進行驗證,結果顯示波形蛋白主要表達于腎小球且IUGR組的表達明顯高于正常對照組,而串珠素可同時表達于腎小球和腎小管且IUGR組的表達明顯低于正常對照組,這一驗證結果與蛋白質組的研究結果相一致。
　　同時,為進一步探討IUGR成年鼠與正常成年鼠腎臟蛋白質表達譜的差異以及生后高蛋白飲食干預對腎臟蛋白質表達譜的影響,對IUGR新生鼠生后

9、分別給予常規(guī)飼料(含22％蛋白質,IUGR組)和高蛋白飼料(含30％蛋白質,高蛋白組)喂養(yǎng)直至12周齡(成年期),同時設立正常對照組(孕期常規(guī)飼料飼養(yǎng)至自然分娩,所生新生鼠仔生后給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)直至生后12周齡)。12周齡時,每組各選取6個腎臟分別混合后抽提總蛋白,雙向凝膠電泳后使用考馬斯亮藍法染色,凝膠圖像分析后切取組間差異明顯的蛋白質點通過質譜儀進行肽指紋譜和串級質譜鑒定。差異表達分析及質譜鑒定結果顯示,與正常對照組相比,共有11個

10、蛋白質在IUGR組和高蛋白組發(fā)生了趨勢一致的表達改變,其中包括參與體內代謝的轉酮醇酶、谷胱甘肽S轉移酶α1、果糖一二磷酸醛縮酶A、烏頭酸水合酶,參與氧化還原的羥酸氧化酶2、長鏈特異性乙酰輔酶A脫氫酶、視黃醇脫氫酶1和谷氨酸脫氫酶1及參與轉錄和凋亡調控的α烯醇酶、α晶體蛋白和核苷二磷酸激酶B,提示這些差異蛋白質可能參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生。另有8個蛋白質僅在高蛋白營養(yǎng)干預后出現(xiàn)差異表達,其中包括參與氧化還原的異檸檬酸脫氫酶、二硫化

11、物異構酶A3和細胞色素bcl復合物,參與凋亡調控的細胞內氯離子通道蛋白1及參與體內代謝的GM2神經節(jié)苷酯活化蛋白、天冬氨酸酰基轉移酶2、?；被崴饷?和5,10-次甲基四氫葉酸合成酶,提示這些差異蛋白質可能參與了高蛋白飲食干預對IUGR大鼠腎臟的影響。同時還發(fā)現(xiàn)有2個蛋白質即抗增殖蛋白和戴帽蛋白(肌動蛋白絲)出現(xiàn)了等級相關的表達差異(正常對照組/IUGR組大于5倍而高蛋白組無明顯表達),提示這2個蛋白質可能同時參與了IUGR生后腎臟

12、病變的發(fā)生及高蛋白飲食干預對腎臟的影響。對抗增殖蛋白進一步通過western blot和免疫組化方法在腎臟組織中對其差異表達進行驗證,結果顯示抗增殖蛋白主要表達于腎小管上皮細胞,IUGR組的表達明顯低于正常對照組而高蛋白組的表達更弱,這一驗證結果與蛋白質組的研究結果相一致。
　　綜上所述,能量代謝異常、氧化還原和凋亡的失衡以及信號轉導和細胞增殖的異?？赡軈⑴c了IUGR大鼠腎單位數(shù)目減少和腎臟發(fā)育的異常。一些關鍵蛋白分子如谷胱甘肽S

13、轉移酶α1、α烯醇酶、核苷二磷酸激酶B、α晶體蛋白等可能參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生,另一些關鍵蛋白分子如異檸檬酸脫氫酶、細胞內氯離子通道蛋白1等可能參與了高蛋白飲食干預對IUGR者腎臟的影響,而抗增殖蛋白和戴帽蛋白(肌動蛋白絲)則可能同時參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生及高蛋白飲食干預對腎臟的影響。蛋白質組學的方法為研究IUGR腎臟發(fā)育異常和生后腎臟損害的可能機制以及探討生后高蛋白飲食干預對腎臟影響的發(fā)病機理提供了新的研究線索和思