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文檔簡介
1、目的： 本研究優(yōu)化構建包裝純化攜帶標記基因GFP的重組雜合型AAV載體，用各重組雜合型AAV載體感染來源于人的造血干/祖細胞，篩選高效轉(zhuǎn)導人的造血干/祖細胞的雜合型AAV載體，以此構建攜帶β-珠蛋白基因的雜合型AAV載體，轉(zhuǎn)導流產(chǎn)的β-重型地貧胎兒骨髓源造血干/祖細胞，將轉(zhuǎn)染后的細胞移植入照射裸鼠體內(nèi)，系統(tǒng)檢測受體鼠內(nèi)人β-珠蛋白基因的表達水平，篩選出高效轉(zhuǎn)導的雜合型AAV載體。
結果：⑴采用密度梯度離心法結合免疫磁珠分離
2、法獲取人造血干/祖細胞，流式檢測分離純度，集落培養(yǎng)檢測分化潛能和生物學活性；密度梯度離心法結合貼壁法體外培養(yǎng)獲取人骨髓MSCs，分別誘導MSCs向成脂肪和成骨分化。結果表明通過免疫磁珠分離法可以獲得高純度的造血干/祖細胞，集落培養(yǎng)說明其具有較高的分化潛能和生物學活性；體外原代和傳代培養(yǎng)可獲得高效擴增能力的MSCs。⑵通過磷酸鈣共沉淀，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，肝素-瓊脂糖法包裝純化含有目的基因的rAAV病毒載體；通過SDS-PAGE蛋白電泳，點雜交
3、檢測，細胞感染等檢測rAAV的純度、滴度和生物活性。結果表明包裝純化的rAAV具有較高的生物學活性，能成功感染細胞。⑶用rAAV1-GFP，rAAV2-GFP，rAAV6-GFP感染人造血干/祖細胞，流式檢測其感染效率，結果表明rAAV1-GFP或rAAV6-GFP>rAAV2-GFP。在此結果基礎上構建包裝純化獲得rAAV1-β-globin和rAAV6-β-globin，用NOD/SCID裸鼠實驗進一步篩選能高效轉(zhuǎn)導人造血干/祖細胞
4、的rAAV載體。經(jīng)X射線照射后的NOD/SCID裸鼠，輸注經(jīng)rAAV-β-globin感染后的重型β-地中海貧血流產(chǎn)胎兒的造血干/祖細胞，移植后檢測裸鼠體內(nèi)人β-globin的表達。結果表明：WesternBlot檢測移植后裸鼠外周血中人β-globin蛋白，IPP軟件灰度掃描分析結果為rAAV117.12，rAAV613.6。
結論：本研究在體外成功地分離培養(yǎng)出具有高效擴增能力和分化潛能的人造血干/祖細胞和骨髓MSCs，
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