化濁解毒、活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠鈣超載相關機制的影響.pdf

1、目的:缺血性腦血管疾病是臨床常見病、多發(fā)病，其致死率和致殘率高，嚴重威脅人類的健康。腦缺血后的血流恢復在某些情況下能導致進一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復血流灌注后的有害情況稱腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。抑制缺血再灌注損傷成為目前治療缺血性腦血管病的關鍵環(huán)節(jié)。國內(nèi)外研究一致認為CIRI的發(fā)生機制復雜，現(xiàn)代研究表明其發(fā)生主要與鈣超載、興奮性氨基酸毒性、氧化應激反

2、應、腦水腫和細胞凋亡基因被激活等有關。其中能量代謝障礙則被認為是缺血再灌注后細胞損傷的始動環(huán)節(jié)，代謝性毒素引發(fā)的連鎖反應是核心環(huán)節(jié)，細胞內(nèi)Ca2+超載是導致神經(jīng)元死亡的最后通路。由于目前臨床上用于抑制CIRI的西藥主要是干預CIRI某一環(huán)節(jié)或某一途徑的藥物，作用有限，而中醫(yī)具有整體觀和辨證論治的特點，以及中藥多通路多靶點特性，所以近年來中藥尤其是中藥復方的腦保護作用成為CIRI研究的重要內(nèi)容。臨床上導師常用化濁解毒、活血通絡法治療缺血性

3、腦卒中恢復期、血管性癡呆等，對神經(jīng)功能修復甚為有效，但對腦缺血再灌注損傷是否有保護作用尚缺乏實驗研究支持。本實驗擬觀察化濁解毒、活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Ca+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性、腦組織谷氨酸(Glu)含量以及血清鈣調(diào)磷酸酯酶（CaN）含量的影響，同時觀察化濁解毒、活血通絡方對腦缺血再灌注損傷模型小鼠腦組織病理形態(tài)學的影響，并深入探討化濁解毒、活血通絡方對CIRI模型小鼠鈣超載相關機制的影響，為臨床應用提

4、供依據(jù)。
　　 方法:實驗采用雙側頸總動脈夾閉的方法制備急性腦缺血再灌注損傷小鼠模型。健康雄性昆明小鼠50只，隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平對照組（文中簡稱為“尼莫地平組”），化濁解毒、活血通絡方低劑量組（文中簡稱為“低劑量組”），化濁解毒、活血通絡方高劑量組（文中簡稱為“高劑量組”）5組，每組10只(n=10)。假手術組小鼠僅分離雙側頸總動脈，穿線但不結扎，其余各組小鼠均用微型動脈夾結扎雙側頸總動脈，阻斷血流，制備腦缺血再

5、灌注損傷模型。于手術后第2天開始用藥治療。假手術組和模型組均以生理鹽水灌服，尼莫地平組予尼莫地平液灌服，高劑量組和低劑量組灌服化濁解毒、活血通絡方中藥液（化濁解毒、活血通絡方由當歸、丹參、赤芍、石營蒲、郁金、地龍、益智仁、云苓、澤瀉、川芎、黃連等中藥組成，實驗室水煎濃縮）。各組小鼠分別于術后14d斷頭處死，取左側腦組織固定后切片，HE染色，光鏡下觀察腦組織的形態(tài)變化。取右側大腦皮層組織制成勻漿，離心后取上清液，進行腦組織Ca2+-ATP

6、酶及Na十-K+-ATP酶活性的測定及腦組織谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量測定。于小鼠斷頭同時取血，測定血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量。實驗所得數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，統(tǒng)計方法采用方差分析、Dunnett'T3檢驗。顯著性差異水平以0.05，0.01為標準。
　　 結果:
　　 1、各組小鼠腦組織海馬錐體細胞的病理形態(tài)變化:
　　

7、 光鏡下依次觀察五組小鼠腦組織海馬區(qū)的病理形態(tài)學變化，可見“假手術組”小鼠海馬區(qū)錐體細胞排列整齊，層次緊密，細胞核圓而大，核仁清晰:“模型組”小鼠海馬組織呈現(xiàn)缺血性病理改變，錐體細胞脫失明顯，排列紊亂，層次疏松，細胞核固縮，結構模糊。相對而言，各用藥組小鼠海馬區(qū)錐體細胞病變比模型組均有所改善，以“高劑量組”改善最為顯著。
　　 2、各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量的測定結果:
　　 與假手術

8、組相比，模型組小鼠腦組織中Ca+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性明顯減弱（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性明顯增強(P＜0.01）。且高劑量組的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性高于低劑量組及尼莫地平組(P＜0.01)，低劑量組及尼莫地平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 3、各組小鼠腦組織谷氨酸含量的測定結果:
　　 模型

9、組小鼠腦組谷氨酸明顯高于假手術組（P＜0.01）;各用藥組均低于模型組(P＜0.01);用藥各組之間比較:高劑量組的谷氨酸含量低于尼莫地平組及低劑量組(P＜0.01)，低劑量組與尼莫地平組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 4、各組小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量的測定結果:
　　 模型組小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量明顯高于假手術組（P＜0.01）;各用藥組均低于模型組(P＜0.01）;用藥各組

10、之間比較:高劑量組的血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量低于尼莫地平組及低劑量組(P＜0.01），低劑量組與尼莫地平組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、采用夾閉雙側頸總動脈法制備CIRI模型小鼠，術后經(jīng)神經(jīng)病理學證實小鼠海馬錐體細胞受損，說明造模成功。
　　 2、化濁解毒、活血通絡方可改善小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)細胞形態(tài)學表現(xiàn)，減輕海馬錐體細胞的受損程度，改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)細胞損傷。<

11、br>　　 3、化濁解毒、活血通絡方能明顯提高CIRI模型小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性，同時顯著降低谷氨酸(Glu)水平，抑制細胞內(nèi)鈣超載、腦水腫的發(fā)生，減輕興奮性氨基酸對腦的損傷，從而起到保護腦組織的作用。
　　 4、化濁解毒、活血通絡方有降低CIRI模型小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量的作用，可抑制鈣通道信號引起的細胞凋亡，起到減輕腦缺血再灌注損傷的作用。
　　 5、化濁解毒、活血通