ITP血漿對巨核細胞生成影響機制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，ITP)是最常見的自身免疫性出血性疾病，臨床約占出血性疾病的1/3。外周血血小板減少，骨髓巨核細胞數量增多或正常并伴有成熟障礙以及體內檢測到抗血小板自身抗體是其主要特征。ITP的病因迄今未明。免疫因素和感染目前被認為是ITP的主要發(fā)病原因。機體針對自身血小板膜表面糖蛋白，如GP(Ⅱ)b/(Ⅲ)a、GPIb/(Ⅸ)等，產

2、生自身血小板抗體。致敏后的血小板被網狀內皮系統(tǒng)吞噬，最終導致血小板減少。既然血小板減少是因其破壞增多引起，那么從理論上來講，血小板生成則應該代償性增加。但是血小板動力學實驗卻顯示，有2/3的ITP患者的血小板反而表現(xiàn)為生成減少或正常。因此，血小板破壞增多和血小板生成減少兩個因素共同導致了血小板的減少。作為血小板的前體生成細胞，巨核細胞表面也表達血小板膜糖蛋白。血小板自身抗體作用于巨核細胞，使其破壞增多或發(fā)育障礙。研究證實，ITP患者的血

3、漿或者純化的血小板膜蛋白抗體能夠抑制體外巨核細胞生成，導致巨核細胞數量降低，集落形成減少。但是臨床上大多數的ITP患者骨髓內巨核細胞的數量表現(xiàn)為增多或正常，這種巨核細胞的增多多被認為是代償性的。因此，血小板的減少并不能用巨核細胞的減少來解釋。另外，形態(tài)學發(fā)現(xiàn)，這些增多的巨核細胞同時伴有成熟障礙。
　　 巨核細胞的發(fā)育是一個由多因素介導的復雜過程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都有可能導致巨核細胞生成障礙。轉錄因子在巨核細胞發(fā)育過程中起關

4、鍵作用。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類擁有高度保守序列的非編碼小RNA分子，它可以通過調控參與巨核細胞發(fā)育的關鍵性轉錄因子的表達量來調控巨核細胞生成。同一種miRNAs分子可作用于不同的靶基因，多種miRNAs分子也可作用于同一種靶基因。這些miRNAs分子通過各自或聯(lián)合調控其靶基因表達量的方式來對巨核細胞的發(fā)育進行調節(jié)。而巨核細胞的發(fā)育障礙又是ITP的重要發(fā)病機制之一。因此，miRNAs或許可通過調節(jié)巨核細胞的發(fā)

5、育而參與ITP的發(fā)病。
　　 除去自身抗體因素，病毒感染也被認為是ITP發(fā)病的主要原因之一。目前已知的與ITP發(fā)病相關的病毒主要有:單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型、EB病毒、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、流感病毒、巨細胞病毒、風疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒等。病毒是一種極小的非細胞形態(tài)寄生生物，只能依賴宿主細胞進行復制、轉錄或翻譯。研究表明，miRNAs除了存在于真核細胞生物外，也存在于病毒這種非細胞生物中。雖然目前對病毒miRNAs的研究相

6、對來說還比較粗淺，但是已有諸多研究證實，病毒miRNAs可通過與宿主細胞相互作用，從而改變自身或宿主某些miRNAs分子或mRNA的表達，而宿主基因表達的改變也可以反作用病毒，進而促進或抑制病毒復制。目前已有關于病毒miRNAs參與炎癥、腫瘤發(fā)生的報道，但其與巨核細胞生成及ITP發(fā)病之間的關系，卻尚未知曉。因此，探討人miRNAs分子和病毒miRNAs在巨核細胞中的表達情況及與ITP的關系，不僅能為ITP的發(fā)病提供新的線索，而且還能為I

7、TP的臨床診斷和治療提供新的理論依據和治療手段。
　　 實驗方法:
　　 第一章:臍血單個核細胞定向擴增為巨核細胞的研究
　　 用肝素抗凝，收集健康新生兒臍帶血。通過密度梯度離心法，分離臍血單個核細胞。制備體外培養(yǎng)巨核細胞所需細胞因子，包括:重組人干細胞因子(recombinant human stem cell factor，rhSCF)，重組人血小板生成素(recombinant human thrombo

8、poietin，rhTPO)，重組人白介素3(recombinant human inter leukin，rhIL-3)和重組人白介素6(recombinant human inter leukin，rhIL-6)。將分離所得的臍帶血單個核細胞用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸后，按照5×105個/ml種于24孔板中。加入SCF(50ng/ml)、TPO(20ng/ml)、IL-3(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)及左

9、旋谷氨酰胺(2mM)。每孔終體積為1ml。根據細胞因子組合的不同，分為三組:A組SCF+TPO+IL-3，B組SCF+TPO+L-6，和C組SCF+TPO+IL-3+IL-6。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，每3天半量換液，棄去一半的培養(yǎng)基，并添加全量的細胞因子，培養(yǎng)10天。三組細胞除了細胞因子組合的不同外，其他培養(yǎng)條件完全一致。分別通過倒置顯微鏡和光學顯微鏡觀察所得巨核細胞的形態(tài)，并通過流式細胞儀分析比較三組細胞CD41a+細胞的百分比

10、，從而確定體外巨核細胞擴增的最佳體系，為后續(xù)的實驗奠定堅實的基礎。
　　 第二章:ITP患者血漿對巨核細胞的影響
　　 分別收集24例臨床初診的ITP患者和10例正常人的外周血，通過兩步離心法分離出少血小板的血漿。向體外巨核細胞培養(yǎng)體系中分別添加ITP患者血漿和正常人血漿，使血漿占培養(yǎng)體系終體積的10％。除去血漿因素外，其他培養(yǎng)條件完全一致。培養(yǎng)10天后，收集兩組細胞。倒置顯微鏡和光學顯微鏡觀察兩組細胞大體形態(tài)的差別;電

11、子顯微鏡分析比較兩組巨核細胞超微結構的差異;流式細胞術比較兩組巨核細胞的數量差別;基因芯片分析兩組巨核細胞miRNAs的表達差異;實時定量PCR(RealtimequantitativePCR，QRT-PCR)技術對基因芯片的結果進行驗證性實驗。
　　 第三章:病毒miRNAs與ITP
　　 根據基因芯片的結果，篩選出ITP組明顯上調的6個病毒miRNAs分子，包括ebv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BAR

12、T19-3p、hsv1-miR-H7*、hsv1-miR-H8*、hsv1-miR-H14-3p和hsv2-miR-H7-3p。通過QRT-PCR技術分別對ITP血漿孵育組和正常血漿孵育組的巨核細胞進行驗證性實驗，比較兩組巨核細胞病毒miRNAs表達差異是否和基因芯片的結果一致。
　　 統(tǒng)計學方法
　　 實驗資料結果用(x)±S表示，顯著性標準為P＜0.05，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。三組不同細胞因子組

13、合下巨核細胞百分比的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩組血漿孵育下巨核細胞百分比的比較采用非參數檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗，QRT-PCR技術比較ITP組細胞中miR-146a較之正常細胞組的上調倍數采用單樣本t檢驗(One-SampleT-Test)。6種病毒miRNAs分子在ITP組的上調倍數采用One-SampleT-Test。
　　 結果:
　　 第一章臍血單個核細胞定向擴增為巨核

14、細胞的研究
　　 1.倒置顯微鏡下三組巨核細胞的大體形態(tài)三組巨核細胞在倒置纖維鏡下的大體形態(tài)無明顯差異。C組大細胞的比例明顯高于A、B兩組，細胞密度高，體積大。
　　 2.瑞氏吉姆薩染色后觀察巨核細胞形經瑞氏吉姆薩染色后，光學顯微鏡下觀察可見:細胞胞體巨大，胞核不規(guī)則，核染色質排列緊密，胞質粉紅色，內或有大小不等的小顆粒，胞膜不清晰，有偽足伸出。
　　 3.流式細胞術分析比較三組巨核細胞的數量差異巨核細胞特異性表

15、面抗原CD41a的檢測:根據FSC、SSC圈出巨核細胞群，分析CD41a+細胞所占比例。三組數據方差齊，因此采用單因素方差分析(One-wayANOVA)對數掘進行檢驗，其中C組巨核細胞百分比為(36.03±0.27)％，顯著高于A組的(10.23±0.21)％，和B組的(10.10±0.15)％，差異有統(tǒng)計學意義(F=14673.22，P＜0.001)。采用Bonferroni多重比較法分別比較三組細胞數量的差異，結果顯示，C組與A組

16、(P＜0.001)和B組(P＜0.001)的CD41a+細胞百分比均有顯著性差異，而A、B兩組之間無統(tǒng)計學差異(P=1.000)。
　　 第二章:ITP患者血漿對巨核細胞的影響
　　 1.倒置顯微鏡和光學顯微鏡觀察兩組巨核細胞大體形態(tài)的差別與添加正常血漿所得巨核細胞相比，添加ITP患者血漿組所得的巨核細胞數量明顯減少，血小板產量減低。
　　 2.電鏡觀察兩組巨核細胞超微結構的差異正常組巨核細胞的電鏡特點:呈成熟巨

17、核細胞的形態(tài)，直徑大，外形不規(guī)則。核形狀不規(guī)則，分葉，核周有異染色質凝集。胞質內有大量血小板分界膜系統(tǒng)。胞質內有少量分散的核糖體和糙面內質網及大量血小板顆粒，線粒體呈小圓形。糖原顆粒豐富。ITP組巨核細胞的電鏡特點:呈未成熟巨核細胞的形態(tài)。直徑比成熟巨核細胞小，外形不規(guī)則。核大，不規(guī)則，分葉狀，核周亦有異染色質凝集，可見核仁。胞質內核糖體豐富，線粒體小。高爾基復合體發(fā)育良好。血小板分界膜系統(tǒng)幼稚。
　　 3.流式細胞術分析比較兩

18、組巨核細胞數量的差異巨核細胞特異性表面抗原CD41a的檢測:根據FSC、SSC圈出巨核細胞群，分析CD41a+細胞所占比例。比較兩組巨核細胞百分比，數據方差不齊，故因此采用非參數檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗進行統(tǒng)計分析。結果顯示ITP組24例血漿孵育下所得巨核細胞百分比為(11.89±1.62)％，明顯低于10例正常血漿孵育下所得巨核細胞百分比(33.61±3.24)％，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.536，P＜0.001)。<

19、br>　　 4.基因芯片分析兩組巨核細胞miRNAs表達差異對ITP患者血漿孵育所得巨核細胞與正常血漿孵育所得巨核細胞的miRNAs分子進行基因表達譜分析，芯片結果顯示，有89個miRNAs分子在ITP組巨核細胞中上調，上調倍數≥2。其中上調的miRAN分子中包括has-miR-101，has-miR-124*，has-miR-30c-1*，has-miR-146a等人類miRNA分子以及hsv2-miR-H9-3p，hsv1-miR

20、-H7*，ebv-miR-BART19-3p,hsv2-miR-H24,hsv2-miR-H10,hsv1-miR-H17,hsv1-miR-H8*,ebv-miR-BART6-3p,hsv1-miR-H14-3p,ebv-miR-BART8*,sv40-miR-S1-5p,ebv-miR-BHRF1-2,hsv2-miR-H7-3p,hsv2-miR-H6等14個病毒miRNA分子。有63個miRNAs分子在ITP組下調，下調倍數≥2

21、。其中包括has-miR-17,has-miR-106a,has-miR-106b*,has-miR-126*,has-miR-128等人類miRNA分子。下調的miRNA分子中沒有病毒miRNA分子。
　　 5.QRT-PCR對表達差異的miRNAs分子進行驗證從ITP組上調的miRNAs分子中篩選出miR-146a進行驗證實驗。采用單樣本t檢驗分析數據。結果顯示，ITP組細胞中miR-146a的相對表達量為正常組的3.71±

22、0.65倍，兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=20.549，P＜0.001)。這與基因芯片的結果是一致的。再利用24例ITP患者血漿和10正常人血漿直接逆轉錄后進行血漿的QRT-PCR驗證實驗，采用單樣本t檢驗分析數據。結果顯示，ITP組血漿中miR-146a的相對表達量為正常組的3.06±0.75倍，兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=13.430，P＜0.001)。這和細胞中miR-146a的表達結果是一致的。
　　 第三章:病毒miRNAs

23、與ITP
　　 芯片結果顯示的在ITP組中上調的6個病毒miRNAs分子中，除了ebv-miR-BART6-3p在兩組細胞中的表達無差異(t=3.495，P=0.073)之外，ebv-miR-BART19-3p、hsv1-miR-H7*、hsv1-miR-H8*、hsv1-miR-H14-3p和hsv2-miR-H7-3p均在ITP組表達上調，各自的相對表達量均顯著高于正常組巨核細胞(P＜0.05)。這和基因芯片的結果是一致的。

24、
　　 結論:
　　 1.SCF+TPO+IL-3+IL-6的細胞因子組合可較好地刺激臍血單個核細胞體外定向擴增為巨核細胞。
　　 2.ITP患者血漿在體外能使巨核細胞數量降低，成熟障礙。
　　 3.添加正常血漿和ITP血漿后，培養(yǎng)所得的兩組巨核細胞有明顯miRNAs分子表達差異。提示某些miRNAs分子有調節(jié)巨核細胞生成的作用。
　　 4.病毒miRNAs可能通過調節(jié)巨核細胞生成來參與ITP的發(fā)