嚴重燒傷后大鼠骨髓“巨核細胞被噬現象”機制的實驗研究.pdf

1、本室前期研究發(fā)現，單純放射損傷、嚴重燒傷和燒沖復合傷的大鼠、犬骨髓巨核細胞退變，中性粒細胞進入巨核細胞胞漿內將其噬食，命名為“巨核細胞被噬現象”(megakaryocytophagia)，并認為這是嚴重創(chuàng)傷時血小板數量減少、功能降低的主要原因之一。血小板數量和功能的降低是引發(fā)機體出血、感染、多器官功能衰竭的重要因素，是嚴重創(chuàng)傷救治的關鍵環(huán)節(jié)。但巨核細胞被噬現象的發(fā)生是中性粒細胞發(fā)揮清除機體退變細胞的功能，還是巨核細胞受損后發(fā)出某種信號吸

2、引中性粒細胞前往，何種細胞占主導地位，未見有文獻報道。 關于巨核細胞體內有粒細胞或其他血細胞的現象早有文獻報道，但對其性質、發(fā)生機理和意義有不同的看法。有觀點認為巨核細胞體內的其它細胞與巨核細胞是共生的，兩者獨立存在、沒有任何關系；有人認為巨核細胞體內的紅細胞是兩者的重疊；還有人認為巨核細胞有游移的能力，能主動將其它細胞包繞入體內等等。近年來，巨核細胞體內存在其它血細胞的現象更加引起學者們的關注。在血小板減少性紫癜的動物模型、特

3、發(fā)性骨髓纖維化病人的骨髓活檢及骨髓纖維化動物模型、轉染血小板生成素(TPO)的小鼠、核轉錄因子GATA-1低表達的小鼠等情況均發(fā)生不同程度的進入巨核細胞的中性粒細胞數量增加；同時伴有外周血血小板數量減少的現象。巨核細胞是血小板生成的前體細胞，巨核細胞的病理改變及其機能狀態(tài)直接影響到血小板的產生與補充；因此，研究巨核細胞在疾病和損傷情況的改變具有十分重要的意義。 本實驗首先以30％Ⅲ度燒傷大鼠為動物模型，較為系統(tǒng)地觀察了嚴重燒傷后

4、骨髓“巨核細胞被噬現象”；利用在體實驗觀察了嚴重燒傷后調控巨核細胞增殖、分化和不同成熟階段生長因子的表達變化；同時利用體外Transwell穿膜等實驗觀察了正常和嚴重燒傷后大鼠骨髓巨核細胞與中性粒細胞的遷移、游走情況，重點觀察巨核細胞特異性分泌、對中性粒細胞又有特異性趨化作用的細胞因子-中性粒細胞激活肽2(NAP-2)的變化；旨在闡明嚴重創(chuàng)傷后“骨髓巨核被噬現象”可能發(fā)生的機制。主要的方法和結果如下： (一)骨髓組織切片觀察：正

5、常大鼠骨髓中有大量有核細胞，可見處于不同成熟期的巨核細胞，很少見巨核細胞被噬食；30％Ⅲ度燒傷后24h骨髓腔充血明顯，巨核細胞退變，部分巨核細胞胞漿溶解；退變的巨核細胞被中性粒細胞包繞、食噬，呈“蟲蝕樣”改變。采用NAP-2和CD-15分別標記巨核細胞和中性粒細胞，可見深紫色的中性粒細胞在紅色的巨核細胞體內。 (二)燒傷后調控巨核細胞增殖、分化和成熟的細胞因子表達變化PF-4和NAP-2是巨核細胞分泌的特異性蛋白。正常組PF-4

6、主要分布在較為幼稚的巨核細胞胞漿，成熟巨核細胞表達量較低；燒傷后24hPF-4在巨核細胞的表達明顯減弱；燒傷后15d:PF-4在巨核細胞的胞漿表達增加，明顯高于燒傷后24h組，但仍低于正常組。NAP-2在正常巨核細胞胞漿、胞膜表達均為陽性；燒傷24hNAP-2表達明顯減弱；燒傷后15d表達增加，強于燒傷后24h組，但弱于正常組的表達。TPO和IL-3是巨核細胞增殖和分化的正調節(jié)因子，TGF-β1和P-seletin是其負調控因子。TPO

7、主要分布在較為正常成熟的巨核細胞胞漿和胞膜；燒傷后24hTPO在巨核細胞的表達降低；燒傷后15dTPO表達仍低于正常組和燒傷后24h組。燒傷后24hIL-3在骨髓細胞的表達與正常對照組相比降低，15d時仍較低。正常巨核細胞胞漿和胞膜均表達TGF-β1；燒傷后24h在巨核細胞的表達略有下降，無統(tǒng)計學差異；燒傷后15d表達減弱，與正常組比較有統(tǒng)計學意義。P-seletin在正常巨核細胞胞漿和胞膜均表達；燒傷后24h表達下降；燒傷后15d表達

8、弱于正常組和24h組。GATA-1和NF-E2分別參與了巨核細胞早期增殖和晚期分化成熟。GATA-1在正常骨髓幼稚和成熟巨核細胞的胞漿和胞核表達；燒傷后24hGATA-1在較幼稚的巨核細胞表達明顯減弱，而在體積較大形態(tài)易于辨認的成熟巨核細胞表達陽性，主要分布在胞漿和胞核；燒傷后15dGATA-1在幼稚和成熟巨核細胞的表達均減弱。與正常對照組相比，燒傷后24hNF-E2表達減弱，燒傷后15d表達仍弱于前兩者。 (三)燒傷后巨核細胞

9、超微結構的改變掃描電鏡觀察：正常大鼠骨髓巨核細胞呈圓形，表面光滑，燒傷后24h巨核細胞呈不規(guī)則形狀，表面不平整，呈現出“珊瑚樣”改變。透射電鏡觀察：正常大鼠骨髓巨核細胞胞漿有豐富的線粒體、內質網和成熟顆粒，胞核呈分葉，染色質呈細顆粒狀彌散分布，燒傷后24h巨核細胞胞漿細胞器減少，有局灶樣壞死，并可見中性粒細胞伸出“偽足”進入到巨核細胞的胞漿中，核皺縮，染色質濃縮邊集。 (四)燒傷后中性粒細胞的形態(tài)和功能的變化掃描電鏡觀察中性粒細

10、胞表面形態(tài)改變：正常大鼠中性粒細胞表面較光滑，呈圓形或橢圓形，燒傷后24h的中性粒細胞表面呈不規(guī)則狀，有偽足樣突起形成。墨汁吞噬實驗顯示燒傷后24h的中性粒細胞吞噬比率(64.35％)明顯高于正常對照組(15.17％)。 (五)Transwell雙室培養(yǎng)系統(tǒng)體外觀察中性粒細胞向巨核細胞的趨化游走現象分離正常組和燒傷后24h大鼠骨髓巨核細胞和外周血中性粒細胞，在Transwell雙室內進行交叉培養(yǎng)(上室為中性粒細胞，下室為巨核細胞

11、，微孔濾膜孔徑為5岬)。分為：正常中性粒細胞+正常巨核細胞共培養(yǎng)組；燒傷中性粒細胞+燒傷巨核細胞共培養(yǎng)組；正常中性粒細胞+燒傷巨核細胞共培養(yǎng)組；燒傷中性粒細胞+正常巨核細胞共培養(yǎng)組；上室中性粒細胞下室僅有IMDM培養(yǎng)基為陰性對照組。37℃孵育2-6h后，固定、HE染色、計數穿過微孔到達膜底面的中性粒細胞數，每例10個視野，結果以細胞數/視野表示。結果顯示：陰性對照組未見有中性粒細胞穿過：燒傷中性粒細胞+燒傷巨核細胞共培養(yǎng)組則有大量中性粒

12、細胞穿過；與各組均有顯著性差異(P＜0.01)。同時可見，正常中性粒細胞+燒傷巨核細胞共培養(yǎng)組也有大量中性粒細胞穿過，與正常中性粒細胞+正常巨核細胞共培養(yǎng)組、燒傷中性粒細胞+正常巨核細胞共培養(yǎng)組，以及陰性對照組相比，也有顯著性差異(P＜0.01)。體外培養(yǎng)的巨核細胞表達中性粒細胞趨化因子NAP-2較正常組的減弱。上室內加入NAP-2抗體，對中性粒細胞穿膜無明顯的影響；而上室內加入Ca2+通道抑制劑異搏定后可以明顯抑制中性細胞穿膜。

13、 結論：30％Ⅲ度燒傷后大鼠骨髓腔內充血明顯，巨核細胞退變并被中性粒細胞包繞噬食，發(fā)生骨髓“巨核細胞被噬現象”。燒傷對巨核細胞的影響廣泛而嚴重，可以導致巨核細胞分泌的特異性蛋白NAP-2、PF-4的表達降低；正性調控因子TPO、IL-3表達減弱，而負調節(jié)因子TGF-β1，P-seletin也減少，調控巨核細胞的核轉錄因子GATA-1、NF-E2表達也降低。提示燒傷因素可以影響調控巨核細胞增殖分化各階段細胞因子的表達。燒傷還可以導致巨核

14、細胞超微結構發(fā)生改變，形態(tài)不規(guī)則，呈珊瑚樣改變，有利于中性粒細胞進入。體外Transwell雙室培養(yǎng)提示燒傷后的巨核細胞可以明顯趨化中性粒細胞穿膜，中性粒細胞處于功能活躍狀態(tài)；體外阻斷實驗提示中性粒細胞向巨核細胞趨化游走，與巨核細胞分泌的中性粒細胞趨化因子NAP-2表達無明顯關系，而與Ca2+通道相關。因此，我們提出燒傷后“巨核細胞被噬現象”的發(fā)生與巨核細胞發(fā)生退變和中性粒細胞的吞噬功能增強都相關，是機體損傷后的一種轉歸機制，也說明中性