肝細胞癌病人外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢測和臨床意義.pdf

1、原發(fā)性肝癌(主要是肝細胞癌，hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，發(fā)病率仍持續(xù)升高。目前已成為我國第二位癌癥死亡原因。盡管近幾十年以來在肝癌診治和基礎研究方面均取得了長足的進步，但總體而言，肝癌的預后并沒有得到顯著的改善，5年生存率僅為5％左右。手術(shù)切除仍是最主要的治療方法，轉(zhuǎn)移復發(fā)已成為阻礙HCC病人長期生存的關鍵。因此，臨床上迫切需要探索肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的

2、相關預測指標來優(yōu)化治療方案。對病人預后的準確評估可對高危轉(zhuǎn)移復發(fā)病人增強輔助治療或采用侵襲性較小的治療方案，對低危轉(zhuǎn)移復發(fā)病人避免過度治療，從而使實現(xiàn)治療個體化，提高病人的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)意義上的預后預測指標為腫瘤的臨床病理分期和腫瘤細胞分化分級，該分期和分級能大致反映不同病人術(shù)后生存率的差別。但這些臨床病理特征并不能準確預測轉(zhuǎn)移復發(fā)和病人預后。生物標記物可提供更多信息，有望準確預測轉(zhuǎn)移復發(fā)。 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關的因素均有望成為轉(zhuǎn)

3、移復發(fā)的預測標記物。生物標記可在組織和體液中檢測，體液(特別是血液)檢測不需腫瘤組織標本、技術(shù)相對簡單、便于在同一患者多次重復進行，易于被患者接受，對于預測轉(zhuǎn)移復發(fā)的可能性更為重要。外周血中癌細胞“特異性”標記(如 AFP,MAGE、CK19等) mRNA和蛋白檢測，以及外周血循環(huán)DNA及其遺傳學異常等均已被用于轉(zhuǎn)移復發(fā)的預測。另一重要方面——外周血循環(huán)腫瘤細胞 (circulating tumor cells，CTC)的檢測也已成為近

4、年來研究的熱點。已發(fā)現(xiàn)CTC與多種腫瘤病人的預后相關。但其在肝癌病人中的應用價值尚有爭論，主要是因為采用的檢測方法、標記分子及引物、對象人群和樣本采集的部位與時間不同。 CTC的檢測與分離技術(shù)有多種。根據(jù)腫瘤細胞大于血液中有核細胞的原理分離和富集CTC的方法較為敏感、簡捷，避免了其它分離過程中引起的細胞丟失，且不破壞細胞形態(tài)。本研究中我們采用該方法檢測HCC病人外周血中的CTC，并聯(lián)合單細胞全基因組擴增技術(shù)和比較基因組雜交技術(shù)(

5、CGH)研究CTC中遺傳學異常，并探討手術(shù)對CTC影響及CTC在預測腫瘤術(shù)后近期復發(fā)中的作用。 第一部分肝癌病人外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢測方法的建立及臨床應用 目的：建立一種循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的檢測方法，檢測肝癌外周血的CTC及探討手術(shù)對肝癌病人外周血中CTC數(shù)目的影響。 方法：建立全血濾過富集技術(shù)檢測外周血中CTC。應用肝癌細胞株 HCC97-L經(jīng)濾過富集后測定腫瘤細胞的檢出率以檢測該方法的敏感性，采用該方法

6、檢測術(shù)前75例肝細胞癌(HCC)患者、15例良性病變病人和10例正常健康對照外周血中CTC。其中18例HCC、10例血管瘤和1例局灶性結(jié)節(jié)狀增生病人術(shù)中再次取血檢測 CTC。用細胞角蛋白 8/18(CK8/18)行免疫熒光檢測結(jié)合顯微鏡下形態(tài)學觀察，判斷并計數(shù)腫瘤細胞。 結(jié)果：HCC97-L細胞檢出率在40％～100％之間，平均為68％；75例HCC病人外周血標本中有43(57.3％)例為CTC陽性，細胞數(shù)在1～23之間，其中早

7、期肝癌35例中10例28.6％。對照組為血管瘤例10，局灶性結(jié)節(jié)狀增生1例，肝囊腫4例，術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)CK陽性CTC。18例HCC病人術(shù)中檢出率為100％，明顯高于術(shù)前(61％)，且術(shù)中CTC數(shù)目也明顯多于術(shù)前(分別為20.1個和1.2個)，二者之間差別有顯著意義(P<0.01)。血管瘤和局灶性結(jié)節(jié)狀增生病例術(shù)后可見CK陽性細胞0～1個。 結(jié)論：全血濾過富集法能簡單、快速、有效的檢出肝癌病人外周血中CTC，手術(shù)操作明顯增加肝癌病人

8、外周血中CTC數(shù)目。 第二部分循環(huán)腫瘤細胞的染色體基因組異常研究 目的：檢測HCC病人CTC的染色體基因組的非平衡性改變，探討采用比較基因組雜交間接證明單個CTC的良惡性的可行性。 方法：采用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM) 分離來自第一部分早期(TNM Ⅰ-Ⅱ期)HCC病例中14個和晚期HCC病例(TNM Ⅲ-Ⅳ期)中的16個循環(huán)腫瘤細胞，單細胞全基因組擴增技術(shù)擴增所有分離的單個細胞的全基因組DNA，采用比較基因

9、組雜交技術(shù)(CGH)檢測細胞的染色體基因組異常。結(jié)果：激光捕獲顯微切割30個成功29個，成功率97％；單細胞擴增29個成功27個，成功率93％；CGH結(jié)果顯示27個單細胞中有22個有不同程度的染色體改變，其中早期病例13個細胞中9個有染色體異常，晚期病例14個中有13個有染色體異常。CTC中常見的擴增位置有1q、6p、8q，常見的缺失有 1p、4q、8p、13q、16q、17p。其中9個早期肝癌CTC中有1個存在8p缺失，13個晚期肝癌

10、CTC中有8個存在8p缺失，二者之間的差別有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結(jié)論：單細胞全基因組擴增產(chǎn)物可用于比較基因組雜交。比較基因組雜交技術(shù)可以間接證明單個CTC的良惡性，大部分CTC有基因組的改變。肝癌循環(huán)腫瘤細胞中最常見 1q、6p、8q 擴增的和 1p、4q、8p、13q、16q、17p的缺失。 第三部分肝細胞癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的臨床意義和預后價值研究 目的：探討CTC在HCC外周血中的臨床意

11、義和預后價值。 方法：采用濾過富集法檢測 75 例 HCC 患者、15 例良性病變病人和 10 例正常健康對照的外周血中CTC，用細胞角蛋白8/18(CK8/18)行免疫熒光檢測結(jié)合顯微鏡下形態(tài)學觀察，判斷并計數(shù)腫瘤細胞。 結(jié)果：HCC 早期(Ⅰ-Ⅱ期)病人，CTC的陽性率為28.6％；晚期(Ⅲ-Ⅳ期)時，為 82.5％。兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HBsAg、血清AFP水平、肝硬化、有無包膜和Edmondso

12、n分級與CTC數(shù)目無關(P>0.05)；單發(fā)腫瘤63例中33例陽性，多發(fā)腫瘤12例10例陽性，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；大腫瘤組(>5cm)38例中30例陽性，小腫瘤組(≦5cm)37例中13例陽性，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；外周血中檢測到CTC與肝癌病人術(shù)后一年總體生存率和無瘤生存率的減少有關。 結(jié)論：全血濾過富集法檢測肝癌外周血CTC發(fā)現(xiàn)部分早期腫瘤已有腫瘤細胞的血源性播散；隨著腫瘤進展血