根癌農(nóng)桿菌介導的柑橘轉化體系優(yōu)化與轉LFY、AP1基因植株的培育.pdf

1、柑橘是世界上最重要的常綠果樹之一,其種植面積和總產(chǎn)量均居水果之首。長期以來,運用傳統(tǒng)的育種手段進行柑橘遺傳改良受到珠心胚干擾、性器官敗育、育種周期長以及遺傳上高度雜合等因素的影響,導致育種進程緩慢。轉基因技術自1983年應用到植物育種以來,發(fā)展迅猛,已經(jīng)成為基因功能鑒定不可缺少的手段,也是實現(xiàn)植物目標性狀改良的一種快速和直接的途徑。植物童期長短受開花基因調控,將開花調節(jié)基因轉入植物有望改變童期。本研究以擬南芥花分生組織特異基因LEAFY

2、(LFY)、APETALA1(AP1)為目標基因,以胚性愈傷組織和實生苗上胚軸分別為外植體,通過根癌農(nóng)桿菌介導法進行柑橘遺傳轉化研究,采用GUS組織化學染色和PCR、Southern blotting等技術對轉基因材料進行鑒定,采用real-time PCR技術進行基因表達分析；對不同基因型愈傷組織轉化率存在差異的因為進行了探討；對AP1、LFY基因與內源開花相關基因間的互作進行了分析,并對AP1促進早花的機理進行初步研究:主要結果如下

3、:
　　 1.柑橘基因型、愈傷組織褐化影響轉化率。對15種不同基因型柑橘胚性愈傷組織的轉化特性進行研究的結果表明,a)在篩選過程中,抗性愈傷組織多從褐化組織中再生；b)不同基因型愈傷組織褐化程度不同,其中寬皮橘類及其雜種類基因型愈傷組織的褐化最為嚴重,山金柑和葡萄柚次之,澳洲指橘和伏令夏橙與金柑體細胞雜種的愈傷組織不褐化,甜橙類愈傷組織的褐化表現(xiàn)為褐化、輕微褐化和不褐化；c)褐化嚴重的柑橘基因型轉化率較高,而不褐化類型轉化率較低

4、,表明愈傷組織的褐化程度與轉化率有關；d)愈傷組織的褐化與其本身的總多酚含量有關,總多酚含量高的易表現(xiàn)褐化,而總多酚含量受基因型的影響。綜上所述,推測在根癌農(nóng)桿菌介導的柑橘胚性愈傷組織的遺傳轉化中,基因型通過愈傷組織的褐化間接影響轉化率。而柑橘愈傷組織轉化pBIN-mGFP5的GFP瞬時表達結果,表明總多酚含量高的寬皮橘類及其雜種類基因型的轉化率顯著高于總多酚含量低的柑橘基因型,與前面結果相一致。
　　 2.在前人研究基礎上,進

5、一步優(yōu)化了柑橘愈傷組織轉化再生體系,建立了5步篩選再生法?；谠擉w系,獲得19種基因型的轉基因細胞系245個,其中6種基因型再生,獲得120個轉基因芽系,有34個轉基因株系移栽成活,主要表現(xiàn)在,
　　 1)冰糖橙胚性愈傷組織轉化:a)獲得轉AP1基因的轉化細胞系7個,胚狀體再生率高達88％；再生芽經(jīng)GUS染色、PCR分析鑒定為陽性,Southern雜交結果表明所檢測的4個轉化細胞系中AP1基因均以單拷貝插入；再生芽生根困難,通過

6、試管嫁接獲得了完整植株,但嫁接苗在生長后期表現(xiàn)落葉、芽枯、死亡:b)獲得轉LFY基因的轉化細胞系2個,其中一個獲得再生植株,經(jīng)GUS染色、PCR分析鑒定為陽性,Southern雜交結果表明LFY基因以3個拷貝插入；再生植株初期生長健壯,移栽后表現(xiàn)株形矮小,分枝多,葉片小,整株成叢狀。以上結果表明API、LFY對植株生長有較大影響。
　　 2)椏柑胚性愈傷組織轉化:a)獲得轉LFY基因的轉化細胞系9個,其中4個細胞系獲得再生植株,

7、有3個細胞系經(jīng)PCR檢測為陽性,Southern雜交結果表明外源基因以單拷貝插入；b)獲得轉AP1基因的轉化細胞系113個,其中再生細胞系61個,移栽植株104棵,源自29個株系；移栽株系經(jīng)GUS染色、PCR分析,表明有93％為陽性,經(jīng)Southern雜交表明外源基因以1-2個拷貝插入；轉基因植株腋生組織生長旺盛,多有2-4個分枝/株,與未轉化對照形態(tài)差異較大；real-time RT-PCR結果表明AP1基因在芽中表達量最高,其次是根

8、,而在愈傷組織與胚狀體中表達量較低,內源開花基因CiAP1、CiLFY、CiFT、CiTFL受AP1基因影響發(fā)生上調或下調表達。
　　 3)其他基因型愈傷組織轉AP1基因獲得轉化植株的有,伏令夏橙、Succari甜橙、改良橙與尾張雜種、茶枝柑。
　　 3.以實生苗上胚軸為試材進行轉化,獲得3種基因型的GUS陽性株系42個,其中21個株系移栽成活,18個株系經(jīng)PCR鑒定為陽性。一株轉AP1基因的金柑表現(xiàn)早花性狀。Real-

9、time RT-PCR結果表明轉基因(LFY、AP1)對內源開花相關基因的表達有較大影響。以上結果主要表現(xiàn)在,
　　 1)金柑實生苗上胚軸轉化AP1基因:從1021個外植體中獲得GUS陽性芽19個,平均轉化率為1.86％；從移栽的8株GUS陽性植株中,有6株經(jīng)PCR鑒定為陽性,其中3株(J3、J10、J17)進行了Southern雜交鑒定,表明外源基因以1-5個拷貝插入。轉基因植株生長正常,但平均分枝數(shù)/株大于未轉化對照。轉基因

10、植株(J3)在移栽11個月后開花,而正常植株需3年左右才可開花,表明金柑中異位表達AP1基因可以促進早花。Real-time RT-PCR結果表明AP1基因表達量與其插入的拷貝數(shù)成正相關,而與開花早晚無關；AP1基因通過促進CiLFY與CiFT的表達,抑制CiTFL的表達促進開花。
　　 2)冰糖橙上胚軸切段轉化LFY基因:最終轉化率為8.88％；獲得1株轉AP1基因和12株轉LFY基因的GUS陽性植株；轉化植株生長正常,與未轉

11、化對照無明顯差異；PCR分析表明,除一株轉化LFY基因的植株為陰性外,其余均為陽性；轉LFY基因植株(B1)經(jīng)Southern雜交鑒定,表明外源基因以單拷貝形式插入；real-timeRT-PCR結果表明LFY基因在不同轉基因株系中表達量不同,根中表達量略低于芽；內源開花基因CiAP1、CiLFY、CiFT在不同轉化株系中分別表現(xiàn)上調或下調表達,CiTFL在所有轉化株系中均表現(xiàn)下調表達,表明LFY基因影響內源開花相關基因的表達。