淫羊藿苷及其同系物誘導小鼠胚胎干細胞體外定向分化心肌細胞構效關系及相關信號調控研究.pdf

1、本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷(ICA)及其同系物淫羊藿素(ICT)和去甲淫羊藿素(DICT)均能有效促進小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞，作用強度依次為ICA＞ICT＞DICT[12]，并且細胞內活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)在ICA誘導分化過程中扮演了重要角色[13]。相反，對三者體外抗氧化活性研究顯示，DICT體外抗氧化活性最強，ICT次之，ICA在體外幾乎不表現(xiàn)抗氧化活性[14]。ICA，ICT和D

2、ICT均為異戊烯基黃酮類化合物，研究顯示，當基本結構相同時，黃酮類化合物的抗氧化活性往往與結構有關[15]。ICA，ICT和DICT。結構差異導致的體外抗氧化活性差異是否是其促分化效果不同的原因，尚未被證實。 因此，本研究擬通過考察ICA，ICT和DICT對ROS信號通路的調控作用，初步對其促分化作用構效關系進行研究，以期揭示此類異戊烯基黃酮化合物促分化作用物質基礎，為新的促心肌定向分化先導化合物發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。進一步我們對其相關

3、信號調控進行了研究，為揭示ICA，ICT和DICT促心肌定向分化深層次機制，闡明其誘導分化藥理作用提供實驗依據(jù)，也為發(fā)展其新應用提供理論支持。 1ICA及其同系物誘導ES細胞定向分化心肌細胞構效關系研究為探索ICA、ICT和DICT誘導ES細胞體外定向分化心肌細胞構效關系，本研究考察了ICA和ICT啟動心肌定向分化過程中對ROS信號通路調控作用，采用熒光分光光度計檢測了ICA和ICT對擬胚體(embryoidbodies，EBs

4、)內ROS水平影響。共孵育抗氧化劑vitaminE或pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶抑制劑apocynin，評價ROS在ICA促心肌定向分化中作用及其與NADPH氧化酶關系。Westernblot和免疫熒光法檢測ICA和ICT作用后胞外信號調節(jié)激酶(extracellul

5、arsignal-regulatedKinase，ERK)、c-Jun氮末端蛋白激酶(c-junN-terminalKinase，JNK)和絲裂素活化蛋白激酶p38(mitogen-activatedproteinKinasep38，p38MAPK)磷酸化水平變化，并觀察選擇性抑制p38MAPK及ERK后對ICA誘導心肌細胞定向分化的影響。同時考察ICA和ICT介入后，NOX4NADPH氧化酶基因及蛋白表達。 實驗結果顯示，IC

6、A作用EBs2h后能顯著提高細胞內ROS水平，當體系中共孵育vitaminE，PDTC或apocynin時，ICA促ROS產生作用消失。選擇性清除細胞內ROS顯著抑制ICA促心肌細胞定向分化作用，表現(xiàn)為心肌分化率降低，肌細胞增強因子2C(myocyteenhancerfactor2C，MEF2C)基因表達減少。p38MAPK和ERK1，2磷酸化水平分別在ICA介入培養(yǎng)體系30min或2h后上升至最高，而JNK磷酸化水平在觀察的0～4h內

7、無明顯變化。上述ICA誘導的絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)激活作用均可被vitaminE拮抗。p38MAPK抑制劑SB203580或ERK1，2抑制劑U0126對信號通路進行選擇性抑制后，能有效拮抗ICA促分化作用，表現(xiàn)為心肌細胞分化率顯著降低，心肌MEF2C基因表達顯著減少。 進一步研究顯示，ICA和ICT介入分化體系30min后能顯著增加Nox4NADPH氧化酶基因表達，作用2h后能明顯上調其蛋白表達，但ICA和ICT對其

8、誘導效應無顯著差異。ICT作用后EBs內活性氧升高水平，p38MAPK和ERK1，2磷酸化程度均較ICA組少。提示ICA和ICT具有同等效應激活細胞內ROS作用(對NOX4NADPH氧化酶誘導作用相似)，ICT本身具備的抗氧化活性在激活NOX4同時清除了部分ROS，從而導致其下游p38MAPK和ERK1，2激活效應削弱，最終導致其促心肌細胞定向分化作用相對較弱。 本實驗結果提示ICA、ICT和DICT促心肌細胞體外定向分化作用物

9、質基礎是其母核本身，但母核上羥基位置與數(shù)目差異導致的抗氧化活性差異影響了其誘導小鼠ES細胞體外定向分化心肌細胞效應. 2ROS信號通路在ICA啟動心肌細胞定向分化中作用研究第一部分研究從化合物構效關系層面進一步明確了細胞內ROS水平在ES細胞體外定向分化心肌細胞中的作用，基于上述研究結果，為進一步明確ROS信號通路在ICA促心肌細胞定向分化過程中的角色，本部分著重對核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)，活

10、性蛋白(activationprotein-1，AP-1)，及Ca2+信號通路進行了考察。采用Westernblot法檢測ICA介入體系后IκBα和p-IκBα表達，胞質和胞核內NF-κBp65表達，及c-fos和c-jun表達。熒光分光光度計法檢測ICA和ICT介入后對EBs內Ca2+水平影響，共孵育Ca2+螯合劑EGTA或胞內Ca2+清除劑BAPTA/AM后，評價EBs內Ca2+水平對ICA促心肌細胞定向分化作用影響。Western

11、blot法檢測ICA介入后EBs內鈣調神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)及鈣調蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependentkinaseⅡ，CaMKⅡ)表達，并觀察選擇性抑制CaN及CaMKⅡ后對ICA誘導ES細胞體外定向分化為心肌細胞影響。進一步考察ICA介入后EBs內組蛋白去乙?；D移酶4(histonedeacetylases4，HDACA)表達及其與CaMKⅡ關系。最后，共孵育vitaminE、SB20

12、3580或U0126，評價ICA誘導心肌細胞體外定向分化過程中ROS-MAPKs信號通路與NF-κB、AP-1及Ca2+信號通路關系。 結果顯示，ICA作用30min后，EBs內p-IκBa表達顯著增加，IκBa表達顯著減少。ICA與EBs共孵育2h后，胞核內NF－κBp65表達顯著增加，胞漿中表達相應減少。c-fos和c-jun基因或蛋白表達在ICA作用30min或2h后顯著上調。 ICA介入5min后細胞內Ca2+濃

13、度([Ca2+]i)即顯著上升，共孵育EGTA或BAPTA/AM后，發(fā)現(xiàn)其能有效拮抗ICA促心肌細胞體外定向分化作用，表現(xiàn)為心肌分化率降低，心肌MEF2C核轉錄減少，肌小節(jié)蛋白α-輔肌動蛋白(α-actinin)和肌鈣蛋白T(Troponin-T)表達下調。ICA作用48h后CaN及CaMKⅡ表達顯著上升，此作用可被EGTA或BAPTA/AM拮抗。選擇性抑制CaMKⅡ顯著拮抗ICA促分化作用，但CaN抑制后對ICA促分化作用并無顯著影響

14、。ICA作用48h后HDAC4表達顯著降低，選擇性抑制CaMKⅡ后能顯著抑制ICA降低HDAC4表達作用。 共孵育vitaminE后，發(fā)現(xiàn)其能有效拮抗ICA誘導的NF-κB，AP-1激活和[Ca2+]i增加。SB203580或U0126對信號通路進行選擇性抑制后，ICA誘導NF-κB和AP-1激活作用明顯降低，但對[Ca2+]i無顯著影響。 結果提示，ICA促進ES細胞體外定向分化為心肌細胞過程中，一方面，激活的ROS通

15、過p38MAPK和ERK1，2傳遞信號，使NF－κB抑制因子IκBα發(fā)生自身磷酸化并迅速降解，NF-κB和IκBα解離，轉位進入細胞核，同時，活化的p38MAPK和ERK1，2上調c-fos和c-jun表達；另一方面，ROS通過激活細胞內Ca2+，活化CaMKⅡ，導致下游HDAC4降解，其對MEF2C的轉錄抑制作用降低，MEF2C轉錄活性增加，從而促進心肌分化。 以上實驗表明： 1.ICA、ICT和DICT促ES細胞體外

16、定向分化心肌細胞作用與其母核本身密切相關，但母核上羥基位置與數(shù)目差異導致的抗氧化活性差異，可影響該類化合物誘導心肌細胞定向分化效應的強弱。 2.ICA促進EBs向心肌細胞分化過程中，內源性ROS水平迅速升高，一方面，激活的ROs通過p38MAPK和ERK1，2傳遞信號，使NF-κB抑制因子IκBα發(fā)生自身磷酸化并迅速降解，NF-κB和IκBα解離，轉位進入細胞核，同時，活化p38MAPK和ERK1，2上調c-fos,c-jun表