靶向NOB1反義寡核苷酸對人卵巢癌細胞SKOV3影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　通過觀察NOB1反義寡核苷酸(NOB1-ASODN)對人卵巢癌細胞株SKOV3內(nèi)NOB1基因及其mRNA表達的影響,和其對SKOV3細胞的生長繁殖、細胞的凋亡及侵襲力的作用,初步探討NOB1基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。為進一步研究其在卵巢癌及其他腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展的過程中分子調(diào)節(jié)機制;同時為尋找腫瘤靶基因治療的研究提供新的線索和參考依據(jù)。
　　方法:
　　1、設(shè)計合成針對NOB1mRNA的特定NOB1

2、-ASODNs序列以及作為對照的無義寡核苷酸片段NOB1-NSODNs,應(yīng)用轉(zhuǎn)染載體X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent將NOB1-ASODNs及NOB1-NSODNs轉(zhuǎn)染至人卵巢癌SKOV3細胞中。實驗分空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組、無義鏈(NOB1-NSODN)對照組及(NOB1-ASODN)處理組,在倒置熒光相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h不同濃度(0.75μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg

3、/ml)的NOB1-ASODN后各組細胞形態(tài)的變化,同時連續(xù)進行細胞計數(shù)7天,取其均值繪制細胞生長曲線圖,選擇對細胞影響最大的濃度進行后期實驗。
　　2、采用RT-PCR方法從核酸水平檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞NOB1 mRNA的表達情況。
　　3、MTT法檢測在3.0μg/ml濃度的反義核苷酸轉(zhuǎn)染后不同作用時間段(24h、48h、72h)下對各組SKOV3細胞的體外增殖抑制效應(yīng)。
　　4、采用Hoechst33258染色法在

4、倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后48h各組SKOV3細胞凋亡形態(tài)。
　　5、流式細胞術(shù)檢測和分析轉(zhuǎn)染24h不同處理組SKOV3細胞的早期凋亡率。
　　6、利用Transwell小室法檢測轉(zhuǎn)染24h后個處理組SKOV3細胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　1、觀察到NOB1-ASODN能成功轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞,經(jīng)過不同濃度組的NOB1-ASODN作用后的細胞,細胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯改變:邊緣不整齊、欠光滑、細胞間隙可見較多

5、散在的細胞細胞碎片,同時伴隨凋亡小體形成,其中以3.0μg/ml濃度組的作用最明顯,三個對照組的細胞形態(tài)無明顯改變,細胞生長狀態(tài)良好;同時所繪制的細胞生長曲線圖顯示,最高濃度組對細胞生長抑制效果最明顯,與對照組比較,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),選取3.0μg/ml的轉(zhuǎn)染濃度進行后續(xù)實驗。
　　2、RT-PCR結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染后48h,NOB1-ASODN能有效下調(diào)NOB1mRNA的表達水平,且NOB1 mRNA的抑制率達59

6、.58％,與其余3個對照組相比,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),NOB1-NSODN對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組以及空白對照組之間的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、NOB1反義寡核苷酸對SKOV3細胞具有生長抑制作用,且具有一定的時間依賴性,細胞抑制率在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h分別平均達到:37.02%、56.16%、58.10%;與對照組相比,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),3個對照組之間細胞受抑制情況的差

7、異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　4、在熒光顯微鏡下觀察,經(jīng)過NOB1-ASODN作用48h后的SKOV3細胞出現(xiàn)體積變小、呈不規(guī)則狀態(tài)、胞核出現(xiàn)染色質(zhì)聚集,同時可見核碎解,表現(xiàn)出細胞凋亡的形態(tài)。而轉(zhuǎn)染NOB1-NSODN組、轉(zhuǎn)染試劑對照組、空白對照組的細胞其細胞核呈現(xiàn)均質(zhì)淡染的藍色熒光,核呈圓形或橢圓形、比較規(guī)則飽滿。
　　5、經(jīng)NOB1-ASODN作用后,SKOV3的細胞凋亡率明顯升高,與NOB1-NSODN對照

8、組、轉(zhuǎn)染試劑對照組以及空白對照組之間對比,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),各個對照組之間細胞凋亡率相比較,差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);
　　6、Transwell小室侵襲實驗顯示,NOB1-ASODN處理組平均每高倍視野下細胞穿膜數(shù)目明顯減少,同對照組相比,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),余3個對照組之間細胞穿膜數(shù)目的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、NOB1-ASODN可成