木醋桿菌纖維素敷料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在創(chuàng)面的修復(fù)形成過(guò)程中，成纖維細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)bs)、部分細(xì)胞生長(zhǎng)因子及膠原(procollagen，PC)等是關(guān)鍵因素。皮膚缺損后，F(xiàn)bs參與了愈合的全過(guò)程，其中Fbs增殖能力的加強(qiáng)、膠原蛋白合成的增高及細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌含量的變化等是最為重要的生物學(xué)特性改變之一，通過(guò)不同途徑改善Fbs生物學(xué)特性可以進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面加速愈合。除了組織本身的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)外，創(chuàng)面的外部環(huán)境對(duì)組織愈合也有著非同

2、尋常的意義，其中創(chuàng)面的無(wú)菌條件、周圍的濕潤(rùn)環(huán)境等外部因素是影響其愈合的關(guān)鍵。根據(jù)臨床調(diào)查，目前創(chuàng)面一般不會(huì)被直接暴露在外界環(huán)境中，而是需要敷料進(jìn)行包扎，所以敷料對(duì)創(chuàng)面形成的環(huán)境直接影響著其愈合進(jìn)程。目前人們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)合成的生物敷料克服了以往敷料的缺點(diǎn)，具有眾多有益于創(chuàng)面愈合的特點(diǎn)，包括含水率高、吸水性強(qiáng)、抗張強(qiáng)度大、生物適應(yīng)性好、抑制創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng)、可促進(jìn)創(chuàng)面愈合等顯著優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)今生

3、物材料研究的熱點(diǎn)之一，同時(shí)BC作為一種新型生物合成敷料在醫(yī)學(xué)界也有了很大的發(fā)展。
　　 Axcd就是由醋酸桿菌屬(Acetobacter aceti，Aa)中的木醋桿菌(Acetobacterxylinum，Ax)在特定條件下產(chǎn)生的BC構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)與植物纖維素的結(jié)構(gòu)基本相同，屬于天然纖維素。由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了目前其它創(chuàng)面敷料的缺點(diǎn)，使其在眾多敷料中脫穎而出。本課題旨在以Axcd為研究對(duì)象，主要研究?jī)?nèi)容分二大部分，前一部分為

4、碩士期間所完成的初步研究，包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以此部分課題作為鋪墊，重點(diǎn)研究Axcd對(duì)Fbs及其它相關(guān)膠原、細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響，以期探討Axcd促進(jìn)創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制，為下一步臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1、了解Axcd對(duì)手術(shù)創(chuàng)面的治療效果及安全性，研究其抑制感染創(chuàng)面細(xì)菌作用機(jī)理及促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。
　　 2、探討Axcd促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞(human skin fibroblast，HSFb

5、)的增殖、膠原合成能力變化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、γ-干擾素(interferon gamma，IFN-γ)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)分泌含量的變化，可能與其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制有關(guān)。
　　 方法：
　　 1、選用9只小型豬，完全隨機(jī)分為3組，每組3只，每只小豬制作感染創(chuàng)面模型6個(gè)，

6、制備10分鐘內(nèi)各創(chuàng)面接種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)和大腸桿菌(Escherichia coli，EC)混合菌液，Axcd為實(shí)驗(yàn)組、新霉素黃連素溶液抗菌紗布為對(duì)照組一、凡士林紗布為對(duì)照組二，觀察其創(chuàng)面用三種敷料覆蓋后促進(jìn)愈合、控制傷口感染方面的療效和安全性。
　　 2、采用消化分離法進(jìn)行Fbs的原代培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)法鑒定Fbs。第6代純化的Fbs隨機(jī)分為2組，1組與木醋桿菌纖維

7、素敷料共同培養(yǎng)，1組設(shè)為空白對(duì)照組。培養(yǎng)24、48、72h后，經(jīng)MTT法檢測(cè)每孔的光吸收值(OD值)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，應(yīng)用堿水解法檢測(cè)培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量變化，檢測(cè)2組培養(yǎng)72h后的培養(yǎng)上清液中Ⅰ型與Ⅲ型膠原含量及其比值的變化。相應(yīng)ELISA試劑盒分別檢測(cè)24h及48h后細(xì)胞上清液中TGF-β1、IFN-γ及bFGF的分泌含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、從術(shù)后第1天起每隔4天測(cè)定一次細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果表

8、明用藥后第5d、9d、13d及17d的細(xì)菌累計(jì)抑制率實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組一和二明顯高。經(jīng)創(chuàng)面直接觀察和病理組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面比對(duì)照組一和二用藥后創(chuàng)面愈合時(shí)間提前3～5天。Axcd對(duì)動(dòng)物血化驗(yàn)和肝、腎功能均無(wú)明顯影響，未見(jiàn)局部致敏和全身癥狀。
　　 2、Axcd加入到Fbs中培養(yǎng)24、48、72h后，經(jīng)MTT法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組OD值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞周期時(shí)項(xiàng)分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期S+G

9、2/M期細(xì)胞百分率及增殖指數(shù)PI值較空白組增高(P＜0.05)，并且在不同時(shí)間段時(shí)其成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量均明顯高于空白組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與空白組比較，培養(yǎng)上清液中Ⅰ型與Ⅲ型膠原含量增高，Ⅰ型與Ⅲ型膠原比值下降(P＜0.05)。相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)TGF-β1含量：培養(yǎng)24 h細(xì)胞TGF-β1分泌含量空白對(duì)照組為89.27±9.85 pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為134.75±12.40 pg/ml，48 h細(xì)胞TGF-β1含

10、量空白對(duì)照組為128.48±10.53pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為188.32±15.68 pg/ml。ELISA檢測(cè)IFN-γ分泌含量：培養(yǎng)24 h細(xì)胞IFN-γ含量空白對(duì)照組為108.35±10.24pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為73.56±8.73pg/ml，48 h細(xì)胞IFN-γ含量空白對(duì)照組為130.25±14.50pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為85.78±13.62pg/ml。ELISA檢測(cè)bFGF分泌含量：培養(yǎng)24 h細(xì)胞bFGF含量空白對(duì)照組為30

11、.53±6.32pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為48.35±8.87pg/m1，48 h細(xì)胞bFGF含量空白對(duì)照組為42.65±5.45pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為65.20±7.36pg/ml。
　　 結(jié)論：
　　 Axcd所具有的柔軟、光滑、濕潤(rùn)、制作隨意性及緊密貼合性等特點(diǎn)，使其應(yīng)用范圍大大增加，并且減少了感染性創(chuàng)面細(xì)菌的侵入。其對(duì)創(chuàng)面SA和EC的抑制率在起效時(shí)間和強(qiáng)度上都優(yōu)于其它兩組敷料，能有效促進(jìn)HSFb的增殖和膠原的合成，對(duì)體外