乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)對(duì)Notchl與Snail的調(diào)控及其功能的研究.pdf

1、早在1970年，Sherlock等人的研究發(fā)現(xiàn)在慢性肝臟疾病和原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中存在肝炎相關(guān)澳大利亞抗原，由此提示慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染與肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。到1981年，Beasley等人通過對(duì)中國臺(tái)灣地區(qū)22，707例男性的前瞻性人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)攜帶

2、者較非HBsAg攜帶者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)高出63倍，由此為HBV感染與HCC發(fā)生的關(guān)聯(lián)提供強(qiáng)有力的證據(jù)。
　　在HBV基因組編碼的所有蛋白中，乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitisBvirusXprotein，HBx)作為一個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)多功能調(diào)節(jié)蛋白在病毒感染、復(fù)制、致病和致癌過程中發(fā)揮重要作用。盡管已有部分研究證實(shí)HBx可通過影響細(xì)胞本身信號(hào)通路來激活癌基因信號(hào)在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生(HBV-associatedhepatoear

3、cinogenesis)過程中可能發(fā)揮重要的促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，然而對(duì)于HBx在HBV相關(guān)肝癌(HBV-associatedhepatocellularcarcinoma，HBV-HCC)發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍有許多不明之處。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)作為一個(gè)進(jìn)化上高度保守的局部信號(hào)傳導(dǎo)通路，Notch1信號(hào)在肝癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑制腫瘤形成的作用，但是在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生過程中HBx表達(dá)與Notch1信號(hào)之間的相互作用及其機(jī)制仍有待闡

4、明。此外在慢性HBV感染的HCC患者中發(fā)現(xiàn)有較高的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，盡管近年來HBx與HBV相關(guān)肝癌發(fā)生的病理相關(guān)和重要性引起諸多關(guān)注，但是對(duì)于HBx在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制目前不甚明了，而本研究主要圍繞HBx在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制展開。
　　在本研究的第一部分，發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中表達(dá)HBx可下調(diào)內(nèi)源性的Notch1胞內(nèi)活性片段(Notch1intracellulardomain，

5、ICN1)蛋白水平及其下游靶基因的mRNA水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBx對(duì)Notch1信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控是通過減少Notch1的剪切而不是抑制Notch1轉(zhuǎn)錄或者其配體表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的，而且HBx下調(diào)Notch1剪切的作用是經(jīng)由抑制參與Notch1剪切的γ-分泌酶(γ-secretase)的關(guān)鍵組分presenilinl(Psenl)來介導(dǎo)的。通過HBx瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中HBx可通過下調(diào)ICN1水平來促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖(cell

6、proliferation)、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G1-S期的細(xì)胞周期進(jìn)展(G1-Scellcycleprogression)和抑制細(xì)胞衰老(cellularsenescence)。進(jìn)一步用裸鼠皮下腫瘤移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx也可經(jīng)由下調(diào)ICN1水平鈍化衰老樣生長抑制(senescence-likegrowtharrest)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和腫瘤形成。最后在HBV相關(guān)肝癌患者腫瘤組織樣本中證實(shí)了下調(diào)的Psenl-依賴的Notch1信號(hào)和鈍化的

7、衰老樣生長抑制二者之間的相關(guān)性。結(jié)論：這部分研究闡明了HBx在肝癌發(fā)生過程中的一個(gè)新功能，即通過抑制Notch1信號(hào)活化來鈍化衰老樣生長抑制從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生，該發(fā)現(xiàn)提供了一種可能的HBV相關(guān)肝癌發(fā)生的新機(jī)制。
　　在本研究的第二部分，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中表達(dá)HBx可使肝癌細(xì)胞形態(tài)從上皮型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型、上皮細(xì)胞標(biāo)志分子下調(diào)(如E-cadherin)、β-catenin的核轉(zhuǎn)位以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子的上調(diào)(如N-cadherin、vimen

8、tin和fibronectin)，由此提示HBx表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBx誘導(dǎo)發(fā)生EMT依賴于EMT調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白水平的增加，而Snail蛋白水平的增加是通過HBx表達(dá)增強(qiáng)Snail蛋白穩(wěn)定性，而非通過促進(jìn)Snail轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)的，siRNA干擾Snail可以抑制HBx誘導(dǎo)發(fā)生EMT。此外還證實(shí)HBx表達(dá)通過激活PI3K

9、/AKT/GSK-3β信號(hào)通路來增強(qiáng)Snail蛋白穩(wěn)定性，PI3K/AKT信號(hào)通路特異性的抑制劑LY294002和Wortmannin處理、以及組成性激活型的GSK-3βS9A突變體共轉(zhuǎn)染均可抑制HBx表達(dá)上調(diào)Snail蛋白水平。最后通過體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Collagen細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中HBx表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移(cellmigration)和細(xì)胞侵襲(cellinvasio