三氧化二砷對(duì)人乳腺癌雌激素受體表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 近年來(lái)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)速度較快,全世界每年患乳腺癌的女性約130萬(wàn)人,而死于乳腺癌的有50萬(wàn)人。雖然我國(guó)的乳腺癌屬于低發(fā),但近年來(lái)其發(fā)病率增長(zhǎng)幅度較快,預(yù)測(cè)20年后將會(huì)成為我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤。
　　 雌激素受體(estrogen receptor ER)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,扮演著重要角色。在體內(nèi)通過(guò)與雌激素的結(jié)合,激活含雌激素應(yīng)答元件基因和含有其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件基因的表達(dá),進(jìn)而

2、導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。通常情況下,以ER基因表達(dá)情況的不同可將乳腺癌分為ER朋性乳腺癌和ER陽(yáng)性乳腺癌兩種。其中ER陰性乳腺癌約占20％～35％,其惡性程度高、發(fā)展迅速、有較高的局部復(fù)發(fā)率,并易發(fā)生肺、肝、骨及腦等重要臟器的轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。由于缺乏相應(yīng)的受體不能進(jìn)行內(nèi)分泌和生物治療,所以這類(lèi)特殊乳腺癌的治療僅限于化療,但療效欠佳。因此,作為一個(gè)分子標(biāo)記物,ER在乳腺癌的內(nèi)分泌治療中進(jìn)行效果預(yù)測(cè)、評(píng)估激素依賴性等方面具有重要的意義。
　

3、　 DNA甲基化和染色體重組是當(dāng)前研究ER陰性乳腺癌中ER基因失活的兩大主要學(xué)說(shuō)。甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用,但又是一可逆過(guò)程。從理論上來(lái)說(shuō),如果使用藥物對(duì)甲基化的抑癌基因和癌基因進(jìn)行人為逆轉(zhuǎn),即可使因甲基化失活的基因重新獲得表達(dá)。
　　 三氧化二砷(As2O3)為中藥砒霜的主要成分,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)白血病、原發(fā)性肝癌等多種腫瘤治療取得了較好的效果。主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用,如今多項(xiàng)研究證明其具有甲基

4、化抑制作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度的As2O3對(duì)人ER陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435進(jìn)行藥物誘導(dǎo),使其基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島部分脫甲基而使其重新表達(dá)有功能的ERα,從而使得ER陰性乳腺癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)內(nèi)分泌治療藥物的敏感性。
　　 材料與方法:
　　 (1)常規(guī)培養(yǎng)雌激素受體(ERα)陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435,細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105／ml后換含As2O3的培養(yǎng)液,至As2O3終濃度分別為0

5、.5μmol／L、1.0μmol／L、2.0μmol／L、4.0μmol／L,連續(xù)培養(yǎng)72h。以同期培養(yǎng)不加藥的MDA-MB-435細(xì)胞作為陰性對(duì)照,ERα陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　 (2)RT-PCR方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細(xì)胞ERα的mRNA表達(dá)情況。
　　 (3)甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度As

6、2O3處理后的MDA-MB-435細(xì)胞ERα DNA的5'-CpG島甲基化的情況。
　　 (4)Western blot方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細(xì)胞ERα的蛋白表達(dá)情況。
　　 (5)免疫組化方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細(xì)胞ERα的蛋白表達(dá)情況。
　　 (6)MTT方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度As2O3處理后的MDA-MB-435細(xì)胞,再經(jīng)三苯氧胺(TAM)處理,

7、觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑情況。
　　 (7)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件SPSS16.0,X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05。
　　 結(jié)果:
　　 (1)RT-PCR法檢測(cè)陰性對(duì)照組無(wú)ERα mRNA基因；0.5μmol／L組未擴(kuò)增出ERα mRNA基因;1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組均擴(kuò)增出ERα mRNA基因。
　　 (2)甲基化特異性PCR法檢測(cè)

8、陰性對(duì)照組僅甲基化引物擴(kuò)增出特異PCR條帶；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組甲基化和去甲基化引物均擴(kuò)增出特異PCR條帶。
　　 (3)經(jīng)Western blot檢測(cè)證實(shí)陰性對(duì)照組未顯示蛋白條帶；0.5μmol／L組也未顯示蛋白條帶,但1.0μmol／L組、2.0μmol／L和4.0μmol／L組顯示出蛋白條帶。
　　 (4)經(jīng)免疫組化法檢測(cè)證實(shí)陰性對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率為7

9、.4％；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組細(xì)胞陽(yáng)性率分別為7.8％、43.8％、78.2％、41.5％。
　　 (5)MTT法檢測(cè)TAM作用于經(jīng)As2O3處理的MDA-MB-435細(xì)胞后,細(xì)胞增殖明顯受抑。陰性對(duì)照組受抑率為10.7％；0.5μmol／L組、1.0μmol／L組、2.0μmol／L組、4.0μmol／L組細(xì)胞受抑率分別是14.9％、30.7％、43.1％、56.