桔霉素三聚體Tricitrinol B的抗腫瘤活性及機制研究.pdf

1、極端環(huán)境中的微生物為了適應(yīng)生存,逐步形成了獨特的結(jié)構(gòu)和生理機能,能夠產(chǎn)生多種極端酶和其他生物活性物質(zhì),極端微生物資源是抗腫瘤藥物重要的資源寶庫。本論文首先對從火山口沉積物來源的桔青霉Penicillium citrinumHGY1-5中分離得到的一系列桔霉素衍生物進行初步的抗腫瘤活性篩選,發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)全新的桔霉素三聚體Tricitrinol B具有較強的抑制體外腫瘤細胞生長的作用。本論文較為全面地評價了Tricitrinol B的體外抗腫瘤

2、活性,并檢測了其對拓撲異構(gòu)酶的抑制作用,闡明Tricitrinol B是作為嵌入性的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ毒劑來發(fā)揮抗腫瘤作用的。為了全面地評價Tricitrinol B的體外抗腫瘤作用,選取不同組織來源的17株細胞株進行細胞增殖抑制活性的檢測,結(jié)果顯示Tricitrinol B對各種組織來源的腫瘤細胞株和正常細胞株HMEC均表現(xiàn)出普遍的細胞毒作用,其平均IC50值約為4.77μM。同時檢測Tricitrinol B對兩株p-糖蛋白過表達的多藥耐

3、藥細胞株(KB/VCR和MCF-7/ADM)的細胞毒作用,發(fā)現(xiàn)Tricitrinol B對2株多藥耐藥細胞及相應(yīng)的親本細胞株表現(xiàn)出同等程度的生長抑制作用,平均耐藥因子(RF)約為1,顯著低于阿霉素(ADR)和長春新堿(VCR)的RF,表明Tricitrinol B具有良好的抗多藥耐藥作用。進一步采用DNA Ladder方法證實凋亡是TricitrinolB誘導(dǎo)細胞死亡的方式;采用AnnexinⅤ-FITC方法發(fā)現(xiàn)化合物Tricitrin

4、ol B誘導(dǎo)HL60細胞凋亡具有明顯的濃度和時間依賴性,其在12h時主要誘導(dǎo)細胞發(fā)生早期凋亡,24h主要發(fā)生晚期凋亡;采用JC-1方法發(fā)現(xiàn)Tricitrinol B可以濃度和時間依賴性地降低細胞膜線粒體膜電位;利用Western Blot檢測Tricitrinol B對凋亡關(guān)鍵蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)其可以激活凋亡相關(guān)蛋白caspase-8、Bid、caspase-3和PARP蛋白,引起不可逆的細胞凋亡;運用凋亡抑制劑發(fā)現(xiàn)Tricitrinol

5、 B誘導(dǎo)的細胞凋亡主要依賴死亡受體通路來實現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上,本論文對Tricitrinol B的抗腫瘤機制進行了深入研究。DNA拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase, Topo)具有重要的細胞生物學(xué)功能,已經(jīng)成為抗腫瘤藥物重要的作用靶點。本論文應(yīng)用多個無細胞體系和細胞體系模型對Tricitrinol B的Topo抑制作用進行多方位和多層次的研究和確證,以闡明Tricitrinol B抑制TopoⅡ的具體機制。PBR322解螺旋實驗顯示T

6、ricitrinol B能抑制TopoⅠ的催化活性,但DNA切割實驗和In vivo Complex of Enzyme(ICE)實驗均表明Tricitrinol B不能穩(wěn)定TopoⅠ-DNA可切割復(fù)合物,提示Tricitrinol B的作用機制不同于喜樹堿類化合物,Tricitrinol B對TopoⅠ的抑制作用可能是一種非特異性的抑制作用。與此形成對比的是,PBR322解螺旋反應(yīng)和kDNA去連環(huán)實驗均表明Tricitrinol B能

7、夠劑量依賴性地抑制TopoⅡ的活性;ICE實驗進一步證明Tricitrinol B能夠穩(wěn)定TopoⅡ-DNA形成的可切割復(fù)合物TricitrinolB還能誘導(dǎo)HL-60細胞DNA雙鏈斷裂并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂分子標志y-H2AX蛋白水平升高;利用RNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)下調(diào)TopoⅡα可以降低Tricitrinol B對細胞的凋亡誘導(dǎo)能力。這些結(jié)果表明Tricitrinol B是新型TopoⅡ毒劑,TopoⅡ是Tricitrinol B的作用

8、靶點。為了探討Tricitrinol B發(fā)揮抑制TopoⅡα的具體機制,本論文進一步觀察Tricitrinol B對TopoⅡ的各個催化環(huán)節(jié)的影響。首先,DNA伸展實驗和溴化乙錠取代實驗顯示Tricitrinol B能夠嵌入DNA;其次,DNA遷移實驗表明TricitrinolB能夠抑制TopoⅡ與DNA的非共價結(jié)合;再次,利用DNA切割/再連接實驗證明Tricitrinol B能增強TopoⅡ?qū)η版満秃箧淒NA的切割,也能抑制前鏈和后

9、鏈DNA的再連接,而且Tricitrinol B對后鏈的切割/再連接作用要強于對前鏈的切割/再連接作用,表明Tricitrinol B對前鏈和后鏈的作用有一定程度的選擇性,這一作用與經(jīng)典TopoⅡ抑制劑mAMSA的作用相似。以上研究顯示,TricitrinolB作用如下環(huán)節(jié):嵌入DNA結(jié)構(gòu),抑制酶與DNA的非共價結(jié)合,影響酶對DNA鏈的切割/再連接。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)桔青霉來源的化合物Tricitrinol B具有較好的體外抗腫瘤活性