膠質(zhì)瘤特異性4optHBS-Msi1-GFAP啟動(dòng)子的構(gòu)建評(píng)價(jià)及其在基因治療中的初步應(yīng)用.pdf

1、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤，預(yù)后差，現(xiàn)有治療手段均不能顯著改善該類患者的預(yù)后。由于膠質(zhì)瘤具有原位復(fù)發(fā)的特性使之非常適合基因治療。實(shí)驗(yàn)室前期的工作證實(shí)1型腺相關(guān)病毒(rAAV, recombined adeno-associatedvirus)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率最高，膠質(zhì)細(xì)胞親和性強(qiáng)，很適合用于膠質(zhì)瘤的基因治療。因此尋找并構(gòu)建膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性高效的表達(dá)元件，將為rAAVl用于膠質(zhì)瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 Mu

2、sashil蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP分別是CNS膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)的蛋白，其各自特異啟動(dòng)子均能啟動(dòng)整合在其下游的外源基因表達(dá)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)部處于相對(duì)缺氧微環(huán)境，而優(yōu)化的HIF蛋白結(jié)合位點(diǎn)(optHBS，optimized HIF binding site)序列對(duì)低氧敏感。
　　 實(shí)驗(yàn)中我們利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)出可能的P/Msil序列(M1/2/3/4)，通過(guò)基因克隆技術(shù)，構(gòu)建M1/2/3/4,GFAP及4op

3、tHBS-Msil/GFAP啟動(dòng)子序列，連接到報(bào)告基因載體pGL3-Basic，然后在U251，BT325，HeLa，SH-SY5Y,PC12,293T細(xì)胞系中測(cè)定其相對(duì)熒光活性。
　　 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)M1序列(chr12：119，291，292-119，292，123)為P/Msil活性序列所在。在U251，BT325中P/GFAP較P]Msil有更強(qiáng)的啟動(dòng)子活性；在SH-SY5Y,HeLa中僅有P/Msil有較強(qiáng)啟動(dòng)活性；而在P

4、C12（神經(jīng)元模型），293T中兩者均無(wú)啟動(dòng)子活性，初步證實(shí)了兩啟動(dòng)子的有效性和細(xì)胞特異性。4optHBS-Msil/GFAP啟動(dòng)子功能在0.3％氧濃度下比在19.606下，于U251細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)約4.01倍和2.67倍，于bt325細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)約4.96倍和3.09倍。
　　 最后我們構(gòu)建了40ptHBS-Msil/GFAP-Baxα真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染U251，BT325細(xì)胞，48小時(shí)WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞中Bax表達(dá)