砂梨核微衛(wèi)星位點的開發(fā)和雜交F-,1-代的SSR分析.pdf

1、核微衛(wèi)星(Nuclear Microsatellite，nSSR)是非常有效的分子標記工具，廣泛應用于植物遺傳結構、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關系等研究，但目前梨的nSSR標記還很少.因此，本文應用精確預測法進行了砂梨核nSSR的開發(fā)，能為梨屬果樹及其近緣種遺傳結構、親緣關系等方面的研究提供有效工具。 梨是原產(chǎn)于我國的最古老的果樹種類之一，在水果生產(chǎn)中占有重要的地位.但是目前利用SSR技術構建梨遺傳圖譜的研究和應用較少，而梨遺傳連鎖圖譜的構

2、建和重要農(nóng)藝性狀和基因的定位對于拓展梨屬的基因資源有著重大的意義。故本試驗選用西子綠與喜水為雜交親本及其F1代共77個樣本為作圖群體.運用SSR分子標記技術，初步構建了砂梨分子遺傳圖譜.本試驗獲得的主要成果如下： 1以硅膠干燥保存的梨夏秋葉片為試材，對基因組DNA提取方法進行了研究.通過對CTAB方法的改進，提取梨DNA時不僅快速而且蛋白質(zhì)、RNA、多糖等雜質(zhì)較少，OD260/OD280在1.7-2.0之間，能滿足酶切、PCR等

3、試驗的要求.同時對梅、蘋果、桃、杏等果樹夏秋葉片樣品進行了通用性檢驗，同樣高效快速地獲得了高質(zhì)量的DNA。 2由于具高變異性、重復性、共顯性、在真核生物中的豐富性使得SSR成為在DNA指紋圖譜、親緣關系分析、連鎖圖譜和群體遺傳分析方面有用的分子工具.但SSR開發(fā)方法的效率限制了它的應用.本文利用改進的親和捕捉法來富集微衛(wèi)星，并采用精確預測(AFC)模型來開發(fā)梨SSR分子標記.結果126個陽性克隆中隨機.挑選60個，其中38個克隆

4、獲得了特異的產(chǎn)物富集效率達到63％；根據(jù)模型推薦的前10個克隆進行測序，10個序列均為完整的微衛(wèi)星片段，測序效率達到100％。高效開發(fā)出了梨SSR分子標記。 3通過優(yōu)化PCR反應的退火溫度和反應體系等參數(shù)，篩選多態(tài)性豐富的SSR引物，建立了適合梨的SSR分析技術體系：梨SSR分析的PCR反應體系以251μL為宜，含10×Buffer2.5μL，25mM MgCl21.5μL，2.SmM dNTP1.6μL，15 ng/μL Pr

5、imer各1.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.15μL，模板DNA(50 ng/μL)2.0μL.各引物復性溫度梯度試驗結果表明，所篩選的12對SSR引物的最佳復性溫度在45℃到50℃之間。 從40對SSR.引物中篩選獲得在雙親間存在多態(tài)性的引物12對，多態(tài)性比例為30.7％，這些引物適合用于構建梨遺傳圖譜的SSR分析。 4應用JoinMap3.0軟件，初步構建了西子綠×喜水梨共4個遺傳連鎖群，包括12個孟德爾分離標