脂多糖(LPS)誘導綿羊肺泡巨噬細胞cDNA文庫的構建、EST分析和免疫相關基因的研究.pdf

1、脂多糖（lipopolysaccharide LPS）是革蘭氏陰性細菌胞壁外膜中的一種生物活性成分，在革蘭氏陰性細菌感染的發(fā)病機制中起十分重要的作用，能夠刺激機體免疫系統(tǒng)，誘導炎癥反應，而且作用于抗原提呈細胞，參與誘導抗感染的特異性免疫應答，是早期免疫應答反應的最強刺激劑。本項研究旨在構建LPS誘導的綿羊肺泡巨噬細胞cDNA文庫，為綿羊免疫相關功能基因研究提供基礎平臺；監(jiān)測免疫相關因子（細胞因子、TLR受體和防御素）基因對LPS刺激的應

2、答反應規(guī)律，探討其參與機體抗感染免疫的分子機制；通過基因工程表達相關功能基因并鑒定其生物學功能，為開發(fā)免疫佐劑和治療性藥物奠定基礎。 目前，綿羊各種組織類型的cDNA文庫數(shù)量還很少，可為綿羊基因組研究提供的遺傳標記很有限，導致綿羊基因組物理圖譜研究較其它家畜如牛、豬等研究相對滯后。綿羊功能基因的研究主要集中在經(jīng)濟性狀相關基因，對抗感染免疫相關的因子研究很不充分，綿羊細胞因子、toll樣受體和防御素的表達分布、與病原感染之間的關系

3、以及自身之間相互調節(jié)的聯(lián)系都還不清楚，其表達調控的分子機制對研究疾病的病理過程具有重要意義，有必要進行深入的研究和探討。 本研究通過氣管灌流法從綿羊肺臟分離培養(yǎng)原代肺泡巨噬細胞，利用臺盼藍拒染試驗和雞紅細胞吞噬試驗對其進行形態(tài)學觀察和鑒定，運用SMART技術構建LPS誘導的綿羊肺泡巨噬細胞全長cDNA文庫，隨機挑選255個克隆進行序列測定，通過BLAST/n/x對序列進行比對分析，利用Sequin軟件提交新發(fā)現(xiàn)EST或基因；應用

4、PCR和RT-PCR技術擴增綿羊細胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、TLR受體家族、防御素sBD1和內標（G3PDH，α-Tubulin）基因，對其進行克隆和序列分析，以含有目標基因的質粒為模板建立熒光定量PCR檢測方法，動態(tài)監(jiān)測LPS誘導綿羊肺泡巨噬細胞過程中細胞因子、toll樣受體和防御素的應答反應規(guī)律；應用RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測綿羊防御素sBD1在綿羊不同發(fā)育階段的表達分布及表達差異。建立沙門

5、氏菌感染綿羊消化道模型，檢測防御素sBD1和IL-8對沙門氏菌感染的應答反應，對其抗感染生物學功能進行研究；構建重組綿羊GM-CSF表達質粒電擊轉入酵母細胞，通過甲醇誘導綿羊GM-CSF分泌表達。構建原核表達載體在大腸桿菌中融合表達綿羊防御素sBD1，并對其進行抗菌活性檢測。初步獲得以下結果： （1）構建了脂多糖LPS誘導的綿羊肺泡巨噬細胞全長cDNA文庫，其庫容量達到1.3×106，重組率為95.7％，符合cDNA文庫建庫標準

6、；從255個隨機克隆中發(fā)現(xiàn)新EST或基因45個并提交GenBank，獲得登錄號EU366470-EU366473，EU366475-EU366492，EU366494-EU366497，EU370534-EU370552，未知基因6個； （2）系統(tǒng)地闡明了在LPS刺激0～48h過程中，綿羊細胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、toll樣受體家族和防御素的應答規(guī)律，即IL-1β在LPS刺激后6h達到最高值，I

7、L-8，GM-CSF在誘導后4-12h表達水平最高，IFN-γmRNA水平高峰期在16h以后。toll樣受體1、2、4、6、7、8、9、10均在肺泡巨噬細胞有表達，而toll樣受體3、5則未見表達，TLR2、4在誘導后20min就達到高峰，且在整個誘導過程中維持較高水平； （3）防御素sBD1在綿羊肺泡巨噬細胞中沒有表達，其主要在呼吸道和消化道組織中表達，而且是持續(xù)表達的，其在不同發(fā)育階段消化道表達水平高低為羔羊>成年羊>胎羊。

8、在感染沙門氏菌實驗中IL-8明顯升高，而防御素sBD1表達反而有所降低； （4）在畢赤酵母中誘導表達綿羊GM-CSF，其表達量占總蛋白17％；在大腸桿菌中融合表達了綿羊防御素sBD1，但未表現(xiàn)出抗菌活性。 以上結果表明，本研究成功地構建了脂多糖LPS誘導的綿羊肺泡巨噬細胞cDNA文庫，該文庫為國內首個綿羊肺泡巨噬細胞cDNA文庫，從對文庫克隆的序列分析來看，新的EST和未知功能的基因約占20％，豐富了綿羊基因組物理圖譜的

9、遺傳標記。另外，該文庫是革蘭氏陰性菌主要抗原組分脂多糖刺激巨噬細胞cDNA文庫，為免疫相關的功能基因研究提供了平臺；綿羊幾種主要細胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）對脂多糖LPS刺激表現(xiàn)出時間和表達量的差異為闡明疾病病理狀態(tài)的分子機制提供了科學依據(jù)，toll樣受體3、5和防御素sBD1在脂多糖刺激肺泡巨噬細胞中并不表達，說明肺泡巨噬細胞可能并不是其表達部位，toll樣受體2、4對脂多糖LPS刺激的敏感性很高，說明它

10、們參與早期的免疫應答反應，在革蘭氏陰性菌感染中發(fā)揮重要作用；防御素sBD1在粘膜系統(tǒng)中廣泛分布，并且持續(xù)表達，表明其在粘膜天然免疫中一定發(fā)揮著重要作用，但其對沙門氏菌感染沒有反應，可能是由于其并不直接參與抵抗細菌感染，而與其它類型病原感染有關，而IL-8明顯參與了消化道對沙門氏菌的抗感染免疫；綿羊GM-CSF參與早期的免疫應答，并且在疫苗佐劑和治療性藥物表現(xiàn)出良好應用前景，本研究在酵母中表達綿羊GM-CSF為進行開發(fā)和應用提供材料；防御