純鈦表面堿處理對骨髓間充質干細胞生物學行為的影響.pdf

1、自從Branemark提出骨整合這一概念以來,鈦種植體作為缺牙修復的治療手段,顯著提高了患者的生存質量。種植體骨結合是種植體成功行使功能的重要影響因素[1,2]。種植體表面的理化性能在種植體骨結合中起到重要作用[3-6],從組織學和細胞水平探討種植體與骨結合過程已成為關注的熱點。現階段的研究表明:純鈦表面形貌[7-9]、粗糙度[10-12]、親水性[13-17]及理化特性均對細胞的增殖和分化產生重要影響,進而影響種植體的骨整合[8,18

2、]。骨髓間充質干細胞(BMMSCs)具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,已被廣泛應用于生物醫(yī)學工程領域。許多研究者都將骨髓間充質干細胞作為骨修復的成骨分化來源細胞[19,20]。本研究用梯度濃度NaOH溶液對純鈦試件進行堿處理,觀察不同濃度 NaOH溶液處理對純鈦試件表面納米結構及骨髓間充質干細胞成骨分化的影響。將制備的純鈦試件打磨至2000目。隨機分為實驗組和對照組,實驗組進行梯度濃度(2.5M,5M,7.5M,10M,12.5M)

3、NaOH溶液處理。用掃描電子顯微鏡(SEM)、掃描探針顯微鏡(SPM)對改性后實驗組的表面形態(tài)觀察分析,能量色散X射線光譜儀(EDX)分析表面元素組成及各元素所占比例。用體外骨髓間充質干細胞培養(yǎng)的方法觀察堿處理后純鈦試件不同表面對細胞黏附、增殖、細胞形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)活性和細胞外基質(EMC)礦物質沉積的影響,用酶聯(lián)免疫吸附反應分析(ELISA)測定骨鈣素(OCN)的產出量,用RT-PCR方法檢測了不同表面骨髓間充質干細胞成骨相

4、關基因的表達。
　　結果如下:
　　1.堿處理后的各實驗組純鈦試件表面均形成了形貌相似的多孔納米網狀結構。高倍SEM圖像顯示不同濃度NaOH溶液處理后純鈦試件表面的形貌細節(jié),此相似的納米網狀結構的大小從2.5M組到10M組逐漸減小,在最高濃度12.5M組已不能形成均勻的納米網狀結構。AFM檢測的表面粗糙度(Ra)也呈現出相似的趨勢,從2.5M組到10M組逐漸減小,但12.5M組較10M組略有增大。接觸角隨著堿處理濃度的升高由

5、40°降到6°,但在12.5M組略有升高。堿處理后試件經X線能譜(EDX)檢測分析,結果顯示其表面主要成分為Ti元素及微量的Na和Si元素。各實驗組間Na元素含量無明顯差異。
　　2.試件蛋白吸收檢測,發(fā)現實驗組的蛋白吸收明顯優(yōu)于對照組,且隨著堿溶液濃度的增加而增加,10M組達到頂峰,12.5M組略有下降。
　　3.細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現骨髓間充質干細胞在實驗組試件表面在30min、1h和3h的早期黏附明顯高于對照組試件表面。細胞

6、在實驗組試件表面的早期增殖也明顯高于對照組試件表面,且細胞在10M組的增殖能力最強。
　　4.細胞短期培養(yǎng)30min、1h、3h后,細胞形態(tài)呈相似的紡錘體狀,但偽足的伸展表現出顯著的差異。實驗組試件表面培養(yǎng)細胞偽足的數量和長度隨堿處理濃度的增加而增加,10M處理組試件表面培養(yǎng)細胞偽足數量及伸展長度表現最好。細胞經過3d的培養(yǎng)后,實驗組和對照組試樣表面培養(yǎng)細胞的形態(tài)已發(fā)生改變。對照組的細胞還保持著紡錘體形態(tài),且板狀偽足的數量也較少。

7、實驗組的細胞已經鋪展,且伸展出較多的板狀偽足。
　　5.1w和2w的ALP染色及ALP活性的實驗結果顯示,對照組和實驗組有顯著差異。3w和4w的茜素紅染色,細胞外基質礦物質沉淀以及酶聯(lián)免疫吸附反應分析(ELISA)測定骨鈣素(OCN)的產出量,對照組和實驗組間也表現出顯著差異。
　　6.3d和7d的RT-PCR結果發(fā)現實驗組表面骨髓間充質干細胞的骨涎蛋白(BSP)、骨結合素(ON)、2型轉錄相關因子(RUNX2)、I型膠原(

8、Co1-I)的表達均較對照組均顯著提高。
　　結論:純鈦試件表面經堿(NaOH)處理后形成納米網狀結構,此結構的大小、表面粗糙度、濕潤性及蛋白吸附能力均與堿處理濃度的濃度有關。此納米網狀結構顯著地影響了骨髓間充質干細胞的生物學行為如:黏附、增殖、ALP活性、細胞外基質礦物質沉淀、骨鈣素(OCN)的產出量以及成骨相關基因的表達。這些指標均在NaOH濃度達到10M時升到峰值。本研究結果為下一步的動物實驗提供實驗依據,并為以后的臨床應用