CRISPR-Cas9與TALENs介導奶山羊β-酪蛋白位點基因打靶效率的比較研究.pdf

1、由sgRNA指導Cas9內(nèi)切酶從而特異性的識別基因位點并進行編輯的CRISPR/Cas9是近年興起的一項新技術，相較于之前的鋅指核酸酶技術(Zinc finger nuclease，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活子因子效應物核酸酶技術（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs），CRISPR/Cas9在設計、使用方面更加簡便快捷，并且不需要對序列進行特殊分析，也不需要對應地去尋找

2、識別模塊，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，而且可以在不同的位點同時引入多個突變，其具有極大的應用優(yōu)勢。
　　本實驗是針對β-酪蛋白(β-casein，CSN2)的第二外顯子的一段序列設計并構建了一組TALENs表達載體和一個CRISPR/Cas9表達載體。實驗選用了具有新霉素抗性基因(Neor)表達框架的質(zhì)粒為骨架，構建了兩個針對TALENs、CRISPR/Cas9切割位點的同源打靶載體，分別為p

3、Flrkt和pGlrkt。其外源基因分別為人源化的Fat-1(hFat-1)和EGFP，在CAGG啟動子上游包含長1024bp的5'同源臂，在(Neor)表達框架下游包含長1028bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析及序列測定分析的結(jié)果表明，所構建載體含有正確的CSN2同源片段和外源基因，可用于將外源基因hfat-1和GFP靶向整合到CSN2基因的第二外顯子。
　　為了檢測TALENs與CRISPR/Cas9介導的外源基因的整合效

4、率，通過電轉(zhuǎn)染方法將TALENs: pFlrkt/pGlrk和CRISPR/Cas9: pFlrkt/pGlrkt質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到奶山羊的胎兒成纖維細胞中，在經(jīng)過G418篩選后，一部分鏟取細胞集落，另一部分采用流式分選的方法挑取單克隆細胞，再經(jīng)過同源臂跨臂PCR檢測，最終獲得外源基因定點整合細胞系。經(jīng)過鑒定，在鏟取細胞集落中所得到的68株TALENs介導的pFlrkt定點整合細胞系中共獲得18株打靶細胞，pGlrkt定點整合的34株細胞系中獲

5、得11株打靶細胞，打靶效率分別為26.47％和32.35％;在采用流式分選的方法得到23株TALENs介導的pFlrkt定點整合細胞系中共獲得5株打靶細胞，其打靶效率為21.74％;在鏟取的細胞集落中采用CRISPR/Cas9介導的pFlrkt載體定點整合的35株細胞系中獲得26株打靶細胞，pGlrkt載體定點整合的27株細胞系中獲得19株打靶細胞，其打靶效率分別為74.29％和70.37％;在采用流式分選的方法所得到的17株CRISP

6、R/Cas9介導的pFlrkt定點整合細胞系中共獲得10株打靶細胞，其打靶效率為58.82％。實驗證明，CRISPR/Cas9介導的基因打靶效率要高于TALENs。
　　本實驗最終獲得59株fat-1定點整合細胞系，這些細胞為今后的體細胞核移植、胚胎移植提供了可選的供體細胞。獲得這種敲除β-酪蛋白基因的奶山羊品種，能夠提高羊奶品質(zhì)，降低羊奶加工難度。同時實驗證明，在奶山羊上，CRISPR/Cas9介導的基因打靶效率要高于TALEN