同種異體神經復合體橋接修復兔坐骨神經缺損的實驗觀察.pdf

1、目的：將體外培養(yǎng)提純的胎兔雪旺細胞種植到經化學處理的脫細胞同種異體神經段中制成橋接復合體。然后將橋接復合體移植到兔缺損的坐骨神經上，觀察坐骨神經的再生及功能恢復情況。從而證實橋接復合體既能為再生神經提供良好的支架作用，又能夠誘導和促進神經軸突和髓鞘的再生，為臨床修復神經缺損提供實驗基礎理論。 方法：1、胎兔雪旺細胞的培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔．．處死后迅速取胎兔。在手術顯微鏡下無菌條件下取胎兔雙側坐骨神經，盡可能剝除神經外膜

2、及束膜后將其剪碎。采用雙酶消化法(trypsin/collagenase)和雙差速貼壁法培養(yǎng)和提純雪旺細胞，并輔以神經生長因子(NGF)促進雪旺細胞的生長。倒置相差顯微鏡下觀察雪旺細胞的生長情況，并接種進行傳代，收集生長良好的第二代細胞計數(shù)并應用S-100蛋白免疫組化鑒定。2、去細胞神經橋接體的制備：取成年健康新西蘭白兔，自梨狀肌下緣以遠切取雙側坐骨神經，作為同種異體神經的來源。手術顯微鏡下去除其表面的脂肪組織及部分神經外膜，并將其分為

3、每段3厘米。首先4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經段放入3％Triton X-100(聚氧乙烯辛烷基酚)中靜置12h，然后置蒸餾水中震蕩漂洗6h。如此反復，Triton X-100共作用時間為96h。對萃取的神經段行石蠟切片HE染色及掃描電鏡觀察去細胞的情況。3、種植雪旺細胞的同種異體神經復合體修復兔坐骨神經缺損的實驗觀察：將培養(yǎng)的第二代雪旺細胞以1×10<'8>/ml的濃度用100μI的微量注射器注入神經段內，然后將神經段迅速移植到兔缺損

4、的一側坐骨神經(實驗組)，對照組移植未注入雪旺細胞的去細胞同種異體神經，術后4周，8周，12周大體觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況。通過肌電圖、光鏡、電鏡等方法檢測坐骨神經軸突及髓鞘的再生及功能恢復情況，并進行統(tǒng)計孛分析。 結果：1、雪旺細胞的培養(yǎng)與觀察：經傳代的雪旺細胞倒置相差顯微鏡下計數(shù)并觀察細胞形態(tài)：雪旺細胞的濃度已達到1×10<'8>/ml，其典型形態(tài)呈梭形，有突起，多為雙極，偶見三個細胞突起。胞核明顯，呈卵圓形。細胞呈端

5、對端、肩并肩、漩渦狀或柵欄樣排列生長。內仍白丁見少量成纖維細胞，胞體較雪旺細胞大，扁平狀外形不規(guī)則，突起短而多，核仁明顯，有2到3個核仁，顏色較雪旺細胞淺。2、去細胞神經橋接體的觀察：一般性狀觀察：神經萃取過程中可見兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經呈淡乳白色，無光澤，其外徑及長度較新鮮神經稍減小，柔軟，有韌性。HE染色觀察：神經纖維結構消失，紅染的神經內膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙。掃描電鏡觀察：神經內的軸突、髓鞘已被完全去除，

6、可見由膠原纖維構成的立體管狀結構，部分管腔不規(guī)則。膠原纖維仍維持原有的位置、形態(tài)及結構特征，管內并可見膜樣結構，為雪旺細胞基底膜。3、種植雪旺細胞的同種異體神經復合體修復兔坐骨神經缺損的實驗觀察：術后4周、8周、12周兩組動物手術區(qū)局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應，實驗組足部潰瘍愈合情況、神經纖維數(shù)日、髓鞘及再生神經的超微結構均優(yōu)于對照組。神經傳導速度(NCV)于術后4周時，兩組均未見明顯的神經傳導，術后8周、12周實驗組優(yōu)于對照組。