FOXO1及CGI-58在肥胖慢性炎癥與胰島素抵抗中的作用.pdf

1、肥胖癥是世界性的公共健康問題，是心血管疾病、2型糖尿病等代謝性疾病的高危因素。胰島素抵抗是肥胖相關的代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎。肥胖相關的慢性炎癥，是內臟脂肪、肝臟及肌肉發(fā)生胰島素抵抗的始動因素。
　　 FOXO1是受胰島素信號負性調節(jié)的轉錄因子，通過調控其靶基因，參與調節(jié)肝臟的糖異生、極低密度脂蛋白合成、氧化應激以及凋亡等功能。近來報道FOXO1可在巨噬細胞中上調IL-1β的表達，在脂肪細胞中上調MCP-1及IL-6的表

2、達，提示FOXO1可能是聯系胰島素信號與促炎細胞因子表達的橋梁。動物及臨床研究顯示，單純脂肪肝向脂肪性肝炎發(fā)展過程中，肝臟FOXO1的表達水平顯著增強。然而，在胰島素抵抗的肝細胞中，FOXO1與促炎細胞因子表達的關系尚不清楚。
　　 肥胖導致的異位脂質沉積，可導致肝臟、肌肉等組織產生慢性炎癥及胰島素抵抗。脂代謝紊亂導致的巨噬細胞脂毒性，可誘導抗炎型巨噬細胞(M2)向促炎型巨噬細胞(M1)轉化。內臟脂肪組織中巨噬細胞浸潤及M1/M

3、2比例增高，是肥胖相關的脂肪組織慢性炎癥增強的重要原因。CGI-58是近來報道的甘油三酯水解的激活蛋白，廣泛表達于全身各組織細胞。其基因突變在人群中導致Chanarin-Dorfman綜合征，表現為多個組織臟器的中性脂肪沉積。巨噬細胞中CGI-58在自身脂代謝、全身慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用，目前尚未見任何報道。
　　 [研究目的]
　　 1.在胰島素抵抗的小鼠肝臟中考察FOXO1與慢性炎癥的相關性，并在體外胰島素抵抗

4、的肝細胞模型上探討FOXO1對促炎細胞因子表達的影響及其調控機制；
　　 2.在巨噬細胞CGI-58特異性敲除的小鼠模型上考察巨噬細胞CGI-58敲除對自身及全身脂代謝、全身慢性炎癥及胰島素抵抗的影響及其機制。
　　 [研究方法]
　　 1.在db/db肥胖小鼠模型及高脂喂養(yǎng)誘導的肥胖小鼠模型的肝臟中，應用RT-PCR、real-time PCR、WB及ELISA等方法檢測FOXO1的表達活性與促炎細胞因子的表達

5、水平；并在體外的胰島素抵抗肝細胞模型中，上調或者下調FOXO1的表達活性，考察FOXO1對促炎細胞因子表達水平的影響；應用報告基因分析、ChIP等實驗方法，深入探討FOXO1對CCL20基因的轉錄調控機制。
　　 2.構建巨噬細胞CGI-58特異性敲除(MaKO)的小鼠模型，檢測腹腔巨噬細胞、肝臟、脂肪及血漿的脂質代謝情況；應用GTT、ITT、急性胰島素注射及高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗檢測MaKO及對照小鼠的胰島素敏感性；應用

6、定量RT-real-time PCR、ELISA等方法檢測高脂喂養(yǎng)的MaKO小鼠內臟脂肪、肝臟及全身的促炎細胞因子表達水平；應用內毒素刺激，考察了原代分離的CGI-58缺失的腹腔巨噬細胞及MaKO小鼠的促炎細胞因子表達水平；應用定量RT-real-time PCR、WB、GTT、ITT等方法檢測抗氧化劑NAC對巨噬細胞CGI-58敲除誘導的慢性炎癥及胰島素抵抗的影響。
　　 [研究結果]
　　 1.FOXO1在肝臟胰島素

7、抵抗相關的慢性炎癥中的作用
　　 1.1.首先在肥胖胰島素抵抗的小鼠血漿及肝臟中，檢測了FOXO1表達水平與促炎因子及炎細胞浸潤的相關性。結果顯示：30周齡的db/db小鼠與同窩的雜合子db/+及WT小鼠相比，其體重、空腹血糖及胰島素水平顯著升高；其肝臟有大量脂質沉積，且巨噬細胞、T細胞浸潤增加；其肝臟MCP-1、IL-1β、IL-6、iNOS及CCL20等促炎細胞因子表達水平升高；其肝臟FOXO1的表達顯著升高；高脂喂養(yǎng)誘導的

8、C57/B6肥胖小鼠，其肝臟MCP-1、IL-1β、IL-6及iNOS等促炎細胞因子表達水平升高，同時FOXO1的表達與活性均顯著升高。
　　 1.2.進一步在胰島素抵抗的肝細胞中觀察了FOXO1表達水平對炎癥因子基因表達的影響。結果顯示：低劑量的TNF-α長時間處理HepG2細胞，可顯著抑制胰島素刺激的AKT及IRS-1磷酸化，胰島素刺激的FOXO1磷酸化受到抑制，表明細胞內胰島素抵抗(信號受損)模型的建立成功；TNF-α可促

9、進HepG2細胞中p65的核轉位，并升高MCP-1、IL-1β及IL-6等促炎細胞因子的mRNA水平；應用特異的小干擾RNA將HepG2細胞中FOXO1的表達水平敲低，可顯著抑制TNF-α誘導的MCP-1、IL-1β及IL-6的mRNA水平。
　　 1.3.為了深入探討FOXO1調控促炎因子表達的機制，我們以T淋巴細胞趨化因子CCL-20為靶標，采用基因轉染結合啟動子報告基因分析方法進行了觀察，結果顯示：肝細胞中表達組成活性的F

10、OXO1可增強TNF-α誘導的CCL20 mRNA及蛋白分泌水平，而沉默內源性FOXO1表達得到相反的結果；我們進一步發(fā)現FOXO1可增強TNF-α誘導的CCL20啟動子活性，其活性區(qū)域位于CCL20啟動子轉錄起始位點上游-108～-31區(qū)域；進一步構建位點特異性突變分析表明，CCL20啟動子上的NF-κB元件(-81～-70)在FOXO1聯合TNF-α對CCL20進行調控中起作用；最后經ChIP實驗證實，FOXO1可促進p65/p50

11、異二聚體與CCL20啟動子上的NF-κB(-81～-70)元件相結合，促進CCL20的轉錄和表達。
　　 1.4.為了考察FOXO1促進CCL-20表達的功能意義，我們采用Boyden小室遷移實驗觀察了TNF-α處理的HepG2細胞培養(yǎng)上清對人血液單核細胞(PBMC)遷移的影響。結果表明，在此基礎上高表達組成活性的FOXO1可進一步增強PBMC的遷移活性；而沉默FOXO1的表達可抑制TNF-α對PBMC遷移的誘導作用；而CCL2

12、0抗體可在顯著抑制TNF-α及FOXO1刺激的PBMC趨化功能。
　　 2.巨噬細胞CGI-58在脂代謝、慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用
　　 2.1.首先，我們對巨噬細胞特異的CGI-58基因敲除(MaKO)小鼠的腹腔巨噬細胞及肝臟、脂肪和血漿脂質水平進行了鑒定。結果顯示：(MaKO)小鼠巨噬細胞內大量脂質沉積，脂質譜分析表明甘油三酯(TG)水平顯著升高，而一些特殊種類的神經酰胺(Ceramide)、磷脂酸(PA)及磷脂

13、酰肌(PI)水平降低；正常飲食的MaKO小鼠較之f1/f1對照小鼠，其肝臟TG水平降低，血液TG水平升高；小鼠巨噬細胞CGI-58敲除導致高脂飲食的小鼠肝臟總膽固醇(TC)水平降低。
　　 2.2.其次，我們觀察了不同年齡階段的MaKO小鼠全身胰島素敏感性的狀態(tài)。結果發(fā)現：高脂飲食(HFD)或者正常飲食(CD)16周的MaKO小鼠與f1/f1對照小鼠相比，體重、空腹及餐后血糖水平無基因型相關的差異；MaKO-HFD組較f1/f1

14、-HFD組空腹及餐后胰島素水平及HOMA-IR指數顯著升高；GTT及ITT實驗提示MaKO-HFD組較f1/f1-HFD葡萄糖耐量及胰島素耐量均受損；急性胰島素注射實驗表明MaKO-HFD組較之對照組小鼠，其胰島素刺激的內臟脂肪、肌肉及肝臟中AKT磷酸化水平受損；進一步，在35周HFD的小鼠上進行的高胰島素一正常葡萄糖鉗夾實驗表明：MaKO組的小鼠的葡萄糖輸注率顯著降低。這些結果表明：巨噬細胞CGI-58敲除加重了HFD誘導的全身胰島素

15、抵抗。
　　 2.3.進一步我們觀察了MaKO小鼠血漿、肝臟、脂肪等組織細胞中炎癥因子的表達情況。結果顯示：16周HFD的MaKO組小鼠較之對照組：其血漿TNF-α、IL-6及IL-18水平顯著升高；其肝臟及內臟脂肪組織中炎性細胞浸潤增強，并伴隨著TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子的mRNA表達水平升高；流式細胞術表明其內臟脂肪組織的血管間質細胞浸潤增多，M1型巨噬細胞、B細胞及T細胞數量增多，而巨噬細胞總量及單核細胞總量無明

16、顯差異；原代分離的內臟脂肪細胞及脂肪組織中的巨噬細胞的IL-1β mRNA水平升高。這些結果表明：巨噬細胞CGI-58敲除加重了HFD誘導的全身慢性炎癥。
　　 2.4.為了考察CGI-58基因敲除對巨噬細胞炎癥反應性的影響，我們分離了原代MaKO小鼠腹腔巨噬細胞，經LPS刺激后，觀察了炎癥因子的表達情況。結果顯示：與對照組相比IL-1β表達和分泌特異性升高；CD或者HFD8周的MaKO小鼠經腹腔注射LPS刺激30分鐘后，較之對

17、照組，其血漿IL-18水平升高，而IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的水平無差異。
　　 2.5.為了進一步探討IL-18和IL-1β特異性升高的機制，我們檢測了IL-18和IL-1β的上游炎性體信號通路。結果表明：MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細胞較之對照組，LPS刺激的Nlrp3 mRNA水平顯著升高；16周HFD的MaKO小鼠較之對照組，其附睪脂肪、肝臟、附睪脂肪來源的巨噬細胞中Nlrp3的mRNA水平顯著升高；在基礎或者LP

18、S刺激下，MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細胞較對照組Caspasel活性均顯著升高。這些結果提示：巨噬細胞CGI-58敲除激活了Nlrp3相關的炎性體信號通路。
　　 2.6.為探索巨噬細胞CGI-58敲除激活炎性體的機制，我們檢測了巨噬細胞中炎性體的活化信號活性氧(ROS)產生情況。結果表明：MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細胞活性氧產生增加，并可被抗氧化劑NAC阻斷，進而降低Caspasel的活性，抑制IL-1β的分泌；腹腔巨噬細胞與

19、附睪脂肪體外共培養(yǎng)實驗表明：在LPS刺激下，MaKO來源的腹腔巨噬細胞較之對照組，顯著增強了脂肪組織的JNK及NF-κB炎癥信號，并進一步抑制胰島素刺激的AKT磷酸化水平，而這一作用可被抗氧化劑NAC阻斷。這些體外實驗表明：CGI-58缺失的巨噬細胞經ROS-Caspasel途徑促進IL-1β分泌，進而增強內臟脂肪的炎癥及胰島素抵抗。
　　 2.7.進一步我們在動物水平驗證了MaKO小鼠巨噬細胞中ROS介導的炎性體激活在加重全身

20、慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用。結果表明：16周高脂喂養(yǎng)的MaKO小鼠較之對照組小鼠，其葡萄糖及胰島素耐量均受損，而給予4周NAC喂養(yǎng)可顯著改善MaKO組及對照組的糖耐量及胰島素耐量，并消除基因型之間的差異；NAC喂養(yǎng)后，高脂喂養(yǎng)的MaKO組較之對照組血漿IL-18及TNF-α水平無差異，而IL-6水平顯著降低；肝臟IL-6的mRNA水平降低，TNF-α、IL-1β等水平無差異；附睪脂肪的促炎細胞因子水平表達無差異；同時，炎性體相關基因N

21、lrp3及ASC的mRNA水平在肝臟和脂肪均無基因型相關的差異。這些結果表明：抗氧化劑NAC治療可顯著改善巨噬細胞CGI-58敲除加重的HFD誘導的全身慢性炎癥及胰島素抵抗。
　　 [主要結論]
　　 1.FOXO1在胰島素抵抗的肝細胞中可增強促炎細胞因子的表達；可通過促進p65/p50異二聚體與CCL20啟動子結合而增強肝細胞CCL20的表達和分泌，在胰島素抵抗肝組織炎細胞浸潤及炎癥加重過程中可能具有重要作用。

22、　　 2.巨噬細胞CGI-58缺失可誘導活性氧產生，激活炎性體信號通路，促進IL-1β及IL-18的分泌，增強高脂誘導的全身慢性炎癥，從而加重全身胰島素抵抗。
　　 [研究意義]
　　 胰島素抵抗的肝細胞中FOXO1增強促炎細胞因子及趨化因子基因表達的現象，為揭示胰島素抵抗加重慢性炎癥的分子機制提供了實驗證據。巨噬細胞CGI-58與全身慢性炎癥及胰島素抵抗關系的闡明，揭示了巨噬細胞脂質異常沉積主要通過ROS途徑在慢性炎