重組人源性脂聯素球狀結構的中試工藝及生物活性研究.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命健康的首敵,徹底闡明其發(fā)病機理并尋求相應的治療措施,是當今世界醫(yī)學界亟待攻克的一項重大課題。近年來的研究證明,以糖尿病為突出臨床特征的代謝綜合征是心血管疾病的“原兇”?？刂铺悄虿〖按x綜合征的藥物正成為心血管系統(tǒng)疾病防治的第一戰(zhàn)場。
　　脂聯素主要是由脂肪細胞合成和分泌的細胞因子,能夠調節(jié)糖脂代謝、抗炎癥、抗凋亡、抑制氧化/硝化反應,從而直接或者間接地保護心血管系統(tǒng)。肥胖、2型糖尿病患者血漿脂聯素下降,

2、其對心血管保護作用也減弱。研究表明,給予外源性脂聯素能夠改善糖尿病動物胰島素抵抗,降低血糖、血脂以及減輕動物的心肌缺血再灌注損傷,起到心臟保護作用。脂聯素強大的生物學作用,使其有望成為治療2型糖尿病和心血管疾病的候選藥物,但其大規(guī)模的生產仍是一個難題。
　　全長脂聯素包含4個結構域:信號序列區(qū)、可變區(qū)、膠原樣區(qū)及球狀區(qū)(Globulardomainofadiponectin,gAd),人體正常血液中不僅存在全長型脂聯素,同時也存在

3、脂聯素球狀結構(gAd);脂聯素球狀結構在血液中的含量遠遠小于全長型脂聯素,但其降低血糖、改善胰島素抵抗以及增加脂肪酸氧化的能力要更強于全場型脂聯素。因此活性更強、用藥劑量更少的gAd成為大規(guī)模生產的目標。
　　現階段使用的脂聯素球狀結構(gAd)大多數來源于真核(酵母)以及哺乳動物細胞的表達,其制備工藝復雜、產量低、成本高、耗費時間長,極大地限制了其廣泛的臨床應用。因此建立簡便、廉價的gAd制備工藝是其廣泛應用于臨床的關鍵。

4、r>　　研究目的:
　　1.利用基因工程方法構建人源性脂聯素球狀結構(gAd)基因的原核表達載體,建立工程菌菌種庫,進行中試規(guī)模的擴大發(fā)酵培養(yǎng);優(yōu)化發(fā)酵工藝和純化工藝;并對表達純化產物進行鑒定。
　　2.通過對蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護作用來檢測純化蛋白的生物學活性。
　　實驗方法:
　　1.從正常人脂肪組織里提取總RNA,反轉錄合成cDNA,經PCR擴增、酶切后連入pET

5、-22b(+)載體構建重組質粒pET-22b(+)-gAd。
　　2.重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經低溫、低濃度IPTG誘導使其可溶性表達,采用硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析三步分離純化,得到不帶任何標簽高純度的人源性gAd。
　　3.建立中式發(fā)酵工藝和中式純化工藝,運用SDS-PAGE、Westernblotting、HPLC對重組蛋白進行鑒定。
　　4.通過對蛋白激酶(AMPK)的

6、磷酸化水平和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護作用來檢測純化蛋白的生物學活性。
　　實驗結果:
　　1.成功構建了原核表達載體pET-22b(+)-gAd,實現了人源性gAd在原核細胞中的表達,優(yōu)化了發(fā)酵工藝,使目的蛋白以可溶性形式表達;
　　2.連續(xù)三批發(fā)酵生長良好,發(fā)酵工藝穩(wěn)定、可靠;連續(xù)三批純化結果表明,所獲蛋白純度均大于97％,每批可得到純化產物100mg以上,達到了中試生產的要求,建立了穩(wěn)定、可靠的中試純化工藝

7、。
　　3.活性研究結果表明,純化的人源性gAd能夠明顯的激活HUVECs中AMPK的磷酸化水平以及對小鼠的心肌缺血再灌注損傷起到保護作用
　　結論:
　　1.本研究通過對人源性脂聯素球狀結構(gAd)原核表達載體的構建、中試規(guī)模的發(fā)酵與純化研究,建立了簡單、快速、穩(wěn)定、可靠的生產工藝,獲得了高純度的人源性脂聯素球狀結構(gAd),通過對AMPK的磷酸化水平的檢測和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護作用證明純化出的gAd