無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷技術的改進與應用.pdf

1、傳統(tǒng)的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷對孕婦的損害是不言而喻的。雖然診斷的準確率較高，但有損傷胎兒或導致孕婦流產(chǎn)、感染的可能。1969年，Walknowska等在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒核型的細胞(46，XY)。這使得人們可以通過獲取孕婦外周血中的胎兒細胞，進行無創(chuàng)性的產(chǎn)前基因診斷。這種方法對孕婦和胎兒無損傷，具有取材方便、風險小，不受孕婦年齡和病史等影響的優(yōu)點，是目前產(chǎn)前診斷發(fā)展的方向。有多種富集和分離胎兒有核紅細胞的方法可供選擇：如利用有核紅細胞物理特

2、性的密度梯度離心法，或利用有核紅細胞表面相對特異性抗原的MACS、FACS法，還有利用有核紅細胞內的血紅蛋白γ鏈、ε鏈、ξ鏈的單克隆抗體免疫標記法。本課題組前期利用胎兒有核紅細胞抗血紅蛋白γ鏈抗體標記，獲得特異的胎兒細胞，成功地進行了遺傳病的產(chǎn)前基因診斷。血紅蛋白ε鏈、ξ鏈是出現(xiàn)在孕早期的胚胎血紅蛋白鏈，具有更高的特異性。我們嘗試應用抗血紅蛋白ε鏈抗體標記胎兒細胞，在孕早期進行診斷，以期獲得更準確的結果。選擇抗體標記的方法特異性較高，但

3、成本也較高，同時操作較繁瑣。所以我們建立了利用胎兒和成人血紅蛋白間生化差異的Kleihauer抗酸染色法。這是一種簡單、快速、有效的胎兒細胞標記方法，適合于臨床推廣應用。 標記后的胎兒細胞通過顯微操作方法挑取出來后，必須進行全基因組擴增獲得完整的胎兒基因組序列，以滿足后續(xù)基因診斷的需要。現(xiàn)行的PEP法和DOP-PCR法都是基于PCR的全基因組擴增方法，不可避免會產(chǎn)生非特異性的擴增產(chǎn)物，不完全的位點覆蓋率甚至位點或等位片段的缺失，

4、這些都會對基因診斷的結果造成嚴重的影響。最近一種新的全基因擴增技術：多重置換擴增(MultipleDisplacementAmplification，MDA)，能夠提供高度均一完整的全基因組序列，確保最低的位點擴增誤差，是一種真正意義的全基因組擴增方法。我們用此方法進行胎兒有核紅細胞的全基因組擴增，以探討其在無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷中應用的可行性。 實驗材料與方法20例受試者，其中12例為孕有杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)高風險患兒的孕婦，

5、5例為孕有苯丙酮尿癥(PKU)高風險患兒的孕婦(均來自于本遺傳診斷室的咨詢者)，孕7-25周。1例胎兒臍血作為陽性對照；2例正常未孕女性作為陰性對照。 本實驗以不連續(xù)密度梯度離心法初步富集孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞，細胞涂片離心機制片，然后用抗血紅蛋白γ鏈、ε鏈抗體和Kleihauer抗酸染色法分別標記胎兒有核紅細胞。計數(shù)、定位后在倒置顯微鏡下顯微操作獲取陽性胎兒細胞，對其進行MDA全基因組擴增。然后進行性別鑒定及STR連鎖分

6、析檢測，驗證有核紅細胞的來源，同時完成遺傳病的無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷。 實驗結果經(jīng)抗血紅蛋白ε鏈抗體免疫組化標記，檢測到胎兒有核紅細胞最早期為孕7周，最適孕周為孕7-15周。經(jīng)Kleihauer染色檢測到胎兒有核紅細胞的最早期為孕8周，最適孕周為孕10-22周。檢測數(shù)量從4個/10ml到19個/10ml不等，平均為9.5個/10ml。MDA擴增后的DNA與PEP擴增后的DNA進行瓊脂糖電泳，顯示MDA片段長度＞15kb，而PEP擴增

7、片段平均1kb左右。完成12例DMD的產(chǎn)前基因診斷，檢測出4名男性患兒，4例診斷為正常男性胎兒，1例診斷為女性攜帶者，3例為正常女性胎兒。完成5例PKU的產(chǎn)前基因診斷，檢測出2例患者，2例正常胎兒，還有1例因STR不提供信息而無法診斷。 結論1、選擇更特異的抗血紅蛋白ε鏈抗體標記胎兒有核紅細胞，在孕早期即可進行產(chǎn)前基因診斷。 2、建立一種簡單、快速的Kleihauer抗酸染色法標記胎兒有核紅細胞。 3、國內首次建