約氏瘧原蟲SLARP基因真核表達載體的構建及其免疫活性分析.pdf

1、目的：
　　 瘧疾(malaria)是世界上危害最嚴重的寄生蟲病之一,在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率,全球受瘧疾威脅的人口超過30億。瘧原蟲(Pjasmodium)是引起瘧疾的病原體,是一類單細胞、寄生性的原生動物。在大多數瘧疾流行區(qū),由于抗藥性蟲株和耐藥性蚊媒的不斷產生和擴散,使得瘧疾防治難度不斷加大。因而,迫切需要研制出有效的瘧疾疫苗。瘧原蟲生活史復雜,不同階段引發(fā)免疫反應的抗原也不同。此外還有種株的差異以及瘧原蟲自

2、身的免疫逃避等原因,給瘧疾疫苗的研制帶來了重重困難。目前在研究中的大多數疫苗都只是針對瘧原蟲的紅內期或蚊體階段,不能全面地控制瘧疾。瘧原蟲的基因比細菌病毒的基因大得多,其候選抗原也多,但很多抗原所產生的免疫保護性不強。僅惡性瘧原蟲的抗原就有5300多種,但在已鑒定的約40個疫苗候選抗原中能產生強而持久的保護性免疫反應的抗原卻十分有限。
　　 針對目前瘧疾疫苗研制中存在的這些問題,本實驗以約氏瘧原蟲編碼紅外期肝階段的SLARP基因

3、為抗原基因,構建pcDNA3.1(+)-SLARP真核表達載體,觀察該載體能否在真核細胞中表達及其對動物的免疫效果。以期篩選出一種有效的瘧疾疫苗候選抗原,為進一步開發(fā)阻斷瘧疾感染的核酸疫苗奠定基礎。
　　 方法：
　　 一、構建poDNA3.1(+)-SLARP真核表達載體
　　 設計一對引物,以pGEX6p-1-SLARP質粒為模板,PCR擴增SLARP片段并回收。用限制性內切酶BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切擴增的

4、目的片段及pcDNA3.1(+)載體,回收后用T4連接酶將二者連接,構建成pcDNA3.1(+)-SLARP真核表達載體。HandⅢ/PstⅠ雙酶切構建的載體電泳鑒定并進行測序分析。
　　 二、pcDNA3.1(+)-SLARP表達載體在真核細胞中的瞬時表達
　　 將構建的真核表達載體轉染真核細胞COS7,培養(yǎng)48小時后間接免疫熒光檢測其在真核細胞中的表達情況。
　　 三、SLARP基因真核表達載體在動物體內免疫

5、活性的檢測
　　 (一)動物免疫
　　 BALB/c純系雌性小白鼠51只,隨機分為三組,每組各17只,分別命名為pcDNA3.1(+)-SLARP組、pcDNA3.1(+)空載體對照組、PBS對照組。免疫前在小鼠左后肢股四頭肌注射鹽酸利多卡因0.25mg/只。三天后同一部位分別注射pcDNA3.1(+)-SLARP質粒、pcDNA3.1(+)空載體、PBS。每三周加強免疫一次,共免疫三次。
　　 (二)血清特異性

6、抗體及細胞因子的檢測
　　 每次免疫后兩周,收集各組小鼠的血清及脾細胞培養(yǎng)上清。用ELISA法檢測各組血清中特異性IgG抗體及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b水平,檢測脾細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 各組數據以均數±標準差(-x±SD)表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗,P＜

7、0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 一、pcDNA3.1(+)-SLARP重組載體的鑒定
　　 所得的重組載體經HandⅢ/PstⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳,獲得兩條大小約為4003bp和1915bp的條帶,與預期結果一致。測序分析所得結果與Genebank中SLARP基因序列比對,同源性達100%。
　　 二、pcDNA3.1(+)-SLARP表達載體在真核細胞中的瞬時表達
　　

8、將構建的載體轉染COS7細胞后,可在細胞漿中觀察到綠色熒光,對照組則無綠色熒光。說明該重組質粒能在真核細胞COS7中正常表達。
　　 三、SLARP基因真核表達載體在動物體內免疫活性的檢測
　　 ELISA結果顯示,SLARP基因真核表達載體免疫組的小鼠產生的IgG抗體及其亞類IgGl、IgG2a、IgG2b水平明顯升高,細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平明同樣升高明顯,均高于兩對照組(P＜0.05)