伯氏瘧原蟲T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)蛋白載體的構(gòu)建及其免疫調(diào)節(jié)作用的初步分析.pdf

1、目的：
　　本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對伯氏瘧原蟲TIP（plasmodium berghei，pbTIP）基因的生物信息進(jìn)行分析，從中篩選出所需要的截短基因，然后通過pbTIP基因的克隆，構(gòu)建pbTIP表達(dá)載體;以真核質(zhì)粒免疫實(shí)驗(yàn)動物，使動物體內(nèi)產(chǎn)生pbTIP抗體。用野生型瘧原蟲攻擊已經(jīng)免疫的小鼠，從而達(dá)到封閉小鼠的pbTIP;采用流式細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)分析它在鼠瘧模型中的免疫調(diào)解作用，探索其對宿主免疫系統(tǒng)調(diào)解的影響和變化，進(jìn)而揭示其

2、作用機(jī)制，為瘧疾的預(yù)防和防治奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、pbTIP截短基因的獲取
　　（一）P.berghei TIP抗原預(yù)測分析
　　應(yīng)用抗原決定簇預(yù)測軟件和蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測軟件TMHMMServer v.2.0并結(jié)合文獻(xiàn)報道對pbTIP蛋白的抗原決定簇和跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測分析，確定目的基因片段。
　　（二）P.berghei基因組DNA的提取
　　小鼠腹腔感染1×106 P.Berghei寄

3、生的紅細(xì)胞，每日監(jiān)測外周血紅細(xì)胞感染情況，當(dāng)瘧原蟲癥較重時，小鼠眼球取血，提取瘧原蟲基因組DNA。
　?。ㄈ﹑bTIP截短基因的獲取
　　以伯氏瘧原蟲基因組DNA為模版，設(shè)計特異性引物，PCR方法擴(kuò)增TIP截短基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。
　　二、pbTIP表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)
　　（一）原核表達(dá)載體pET32a-TIP與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TI

4、P的構(gòu)建
　　用限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒，將二者用T4連接酶連接，構(gòu)成原核表達(dá)載體pET32a-TIP與真核載體pcDNA3.1(+)-TIP。原核表達(dá)載體pET32a-TIP轉(zhuǎn)化質(zhì)粒大腸桿菌RGB中，真核載體pcDNA3.1(+)-TIP轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1中，分別篩選陽性轉(zhuǎn)化菌落，鑒定，測序。
　　（二）重組蛋白的表達(dá)與純化
　　將原核表達(dá)載體pET-32a-TIP轉(zhuǎn)入到高效的Ecoli表達(dá)菌株RGB中擴(kuò)增

5、，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，應(yīng)用SDS-PAGE電泳法檢測重組蛋白表達(dá)情況，并采用親和層析法純化表達(dá)的重組蛋白。
　　三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
　?。ㄒ唬┰吮磉_(dá)產(chǎn)物重組蛋白的鑒定
　　將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗分別孵育1∶1000稀釋的抗his標(biāo)簽抗體和重組蛋白免疫小鼠血清，二抗為1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。
　　（二）真核表達(dá)產(chǎn)物檢測
　　轉(zhuǎn)染真核載體pcDNA

6、3.1(+)-TIP/pcDNA3.1(+)的細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot檢測，一抗為1∶40稀釋的抗pbTIP小鼠多克隆免疫血清，二抗為1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的IgG抗體。
　　四、抗pbTIP多克隆抗體血清獲得
　　（一）免疫動物
　　1、蛋白免疫
　　6～8周齡BALB/c雌性小鼠20只，分2組，每組10只。第1組注射TIP重組蛋白，第2組為PBS對照組。用純化的

7、重組蛋白（50μM/小鼠）與福氏完全佐劑混合，免疫小鼠。于第3周和第5周再分別給予兩次加強(qiáng)免疫-50μg/小鼠。
　　2、核酸免疫
　　6～8周齡BALB/c雌性小鼠30只，分3組，每組10只。第1組空白對照組注射PBS（100μg/小鼠），第2組陰性對照組注射注射PBS溶解的空載體pCDNA3.1(+)（100μg/小鼠），第3組實(shí)驗(yàn)組注射PBS溶解的真核載體pcDNA3.1(+)-TIP（100μg/小鼠）。分別于第1周

8、，第3周和第5周給予足量免疫（100μg/小鼠）。
　　（二）血清抗體效價檢測
　　1、原核免疫血清抗體效價檢測
　　每次免疫前一天與末次免疫后第10天，收集每只鼠血清。用重組蛋白作為抗原包被96孔板，應(yīng)用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測蛋白免疫小鼠的血清抗體滴度。
　　2、真核免疫血清抗體效價檢測
　　每次免疫前一天與末次免疫后第10天，收集每只鼠血清。分別用重組蛋白和天然瘧原蟲蛋白作為抗原包被96孔板，應(yīng)用ELI

9、SA實(shí)驗(yàn)方法檢測真核免疫小鼠的血清抗體滴度。
　　五、pbTIP免疫調(diào)解作用初步研究
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)動物感染
　　用1×106 P.berghei寄生的紅細(xì)胞攻擊已經(jīng)用真核載體pcDNA3.1(+)-TIP/對照pCDNA3.1(+)免疫過的小鼠，小鼠感染后觀察小鼠的存活狀態(tài)。
　?。ǘ┝魇郊?xì)胞儀檢測小鼠脾臟細(xì)胞
　　分別在瘧原蟲感染的0d、3d、5d無菌操作取各組小鼠眼球血和脾臟，分離單個脾細(xì)胞，按照B

10、D公司抗體使用說明書進(jìn)行操作，檢測不同感染天數(shù)各組小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
　　六、統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用((X)±SD)表示，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、pbTIP截短基因的獲取
　　篩選P.berghei TIP蛋白抗原決定簇峰值較高且分泌到細(xì)胞外

11、的氨基酸序列作為研究對象，綜上分析選擇PBANKA-124360基因序列中第901-1830位核苷酸序列（基因片段大小為930bp），其中包含有13個抗原決定簇(averageantigenic propensity＞1.15)，且分泌到細(xì)胞外的第300-610個氨基酸進(jìn)行研究。
　　二、pbTIP表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)
　?。ㄒ唬┰吮磉_(dá)載體pET-32a-TIP及真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TIP構(gòu)建
　

12、　應(yīng)用特異性引物對截短基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增片段的大小為930bp，酶切質(zhì)粒與擴(kuò)增的截短基因后進(jìn)行連接，菌落PCR篩選陽性菌落的擴(kuò)增長度均為930bp，公司測序結(jié)果與預(yù)期一致。
　　（二）重組蛋白的表達(dá)與純化
　　轉(zhuǎn)入到高效的E.coli表達(dá)菌株RGB中的原核表達(dá)載體pET-32a-TIP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠表達(dá)蛋白，SDS-PAGE電泳法檢測結(jié)果顯示TIP重組蛋白分子量為大約54kDa左右，為his標(biāo)簽

13、(18kDa)與目的蛋白(36.5kDa)大小之和，與軟件預(yù)測分析結(jié)果相符。
　　三、pbTIP重組蛋白鑒定
　?。ㄒ唬┰吮磉_(dá)產(chǎn)物pbTIP重組蛋白的鑒定
　　Western blot檢測純化重組蛋白，一抗使用his標(biāo)簽抗體，ECL發(fā)光顯示條帶位置出現(xiàn)在大約54kDa左右的位置，為his標(biāo)簽(18kDa)與目的蛋白(36.5kDa)大小之和，與軟件預(yù)測分析結(jié)果相符。
　?。ǘ┱婧溯d體瞬時表達(dá)及驗(yàn)證
　　

14、Western blot檢測真核載體瞬時表達(dá)產(chǎn)物，ECL發(fā)光顯示條帶位置出現(xiàn)在大約36.5kDa左右的位置，與預(yù)測結(jié)果相符合。
　　四、抗pbTIP多克隆抗體血清的獲得
　?。ㄒ唬┒嗫寺】贵w效價檢測
　　1、原核免疫血清抗體效價檢測
　　于初次免疫后，重組蛋白免疫組小鼠血清抗體水平開始出現(xiàn)有意義的升高。兩次加強(qiáng)免疫后抗體一直維持在較高的水平，與PBS免疫對照組相比差異顯著。小鼠血清中特異性IgG水平出現(xiàn)有意義升高

15、的最高滴度為1∶38400(P＜0.05)。
　　2、真核免疫血清抗體效價檢測
　　于初次免疫后，真核免疫組小鼠血清抗體水平升高，兩次加強(qiáng)免疫后抗體水平維持較高的水平，與陰性對照組相比有顯著差異。在以重組蛋白作為抗原包被96孔板時，TIP組小鼠血清中特異性IgG水平出現(xiàn)最高滴度為1∶12800(P＜0.05)。天然蟲蛋白包被96孔板時，小鼠血清中特異性IgG水平出現(xiàn)有意義升高的最高滴度為1∶3200(P＜0.05)。

16、　?。ǘ┲亟M蛋白抗原一致性檢測
　　1、原核表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白抗原一致性檢測
　　Western blot檢測結(jié)果顯示含有天然的抗瘧原蟲抗體能與原核表達(dá)產(chǎn)物TIP重組蛋白結(jié)合，條帶的大小為54kDa左右，與理論值相符。
　　2、原核免疫血清特異性檢測
　　Western blot檢測結(jié)果顯示重組蛋白pbTIP與原核免疫血清能夠結(jié)合，條帶的大小為54kDa左右，說明原核免疫血清的具有特異性。
　　五、pbTI

17、 P免疫調(diào)解作用初步研究
　?。ㄒ唬〤D4+T、CD8+T細(xì)胞檢測分析
　　流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示感染對照組小鼠的CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞顯著高于正常小鼠，而感染TIP實(shí)驗(yàn)組兩種細(xì)胞水平明顯低于對照組（P＜0.05）。
　?。ǘ㏕reg檢測分析
　　試驗(yàn)結(jié)果顯示封閉TIP后能明顯上調(diào)脾臟的Treg水平， TIP實(shí)驗(yàn)組組中的Treg水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、成功