干細胞條件培養(yǎng)液對RGCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的保護作用及機制.pdf

1、目的:
　　1.建立大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系（retinal ganglion cell5，RGC-5）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）模型。
　　2.探討干細胞條件培養(yǎng)液(conditioned medium，CM)對RGC-5的ERS是否具有保護作用。
　　3.通過檢測ERS相關標志物的變化，探討CM發(fā)揮保護作用的可能機制。
　　方法:
　　將RGC-5以1

2、×105個/孔或2×105個/孔接種于12孔或6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為對照組、衣霉素組和治療組。對照組:空白對照組(ND組)為以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的RGC-5，干細胞條件培養(yǎng)液組(NM組)為以完全培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)的RGC-5;衣霉素組:RGC-5接種48小時后，分別以濃度為1μg/ml（1D組）、2μg/ml（2D組）和4μg/ml（4D組）衣霉素干預，以建立RGC-5細胞的ERS模型，衣霉素干預后同時加完全培養(yǎng)基共培養(yǎng);治療組:RGC-5細胞在

3、不同濃度衣霉素干預的同時加入等量的CM共培養(yǎng)（分別為1M組、2M組和4M組）。對照組、衣霉素組和治療組在衣霉素誘導后24小時行Hoechst33342/PI雙熒光活染法檢測細胞凋亡率;采用qRT-PCR法檢測各組在衣霉素誘導后3、6、9、12、24小時PERK、XBP1、ATF6、CHOP的mRNA表達;采用Western Blot法檢測PERK、XBP1、ATF6、CHOP的蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1、在同一濃度衣霉素

4、誘導下，治療組RGC-5的細胞凋亡率明顯低于衣霉素組(P＜0.05)。
　　2、在1μg/ml衣霉素誘導RGC-5損傷后9和12小時，衣霉素組ATF6、XBP1和CHOP mRNA表達水平均較治療組下調(diào)，且誘導后9小時兩組間ATF6 mRNA表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);兩組間PERK mRNA表達水平無明顯區(qū)別。
　　3、在4μg/ml衣霉素誘導RGC-5損傷后，治療組PERK、ATF6、CHOP、XBP1

5、 mRNA表達水平較衣霉素組依次下調(diào)，且均于誘導后12小時兩組間差距最明顯;其中誘導后12小時兩組間XBP1mRNA表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1、衣霉素可成功建立RGC-5的ERS模型。
　　2、CM可對ERS狀態(tài)下的RGC-5有一定的保護作用。
　　3、低濃度衣霉素誘導RGC-5發(fā)生未折疊蛋白反應時，在誘導后9小時，CM可通過ATF6通路增強細胞的未折疊蛋白反應而起到保護作用