APOH基因多態(tài)性與中國人群動靜脈血栓形成的關聯(lián)研究.pdf

1、血栓栓塞性疾病是一種嚴重危害人類健康的常見疾病，包括靜脈血栓栓塞性疾?。ㄉ铎o脈血栓形成、肺栓塞）和動脈血栓栓塞性疾?。ㄐ募∪毖?、缺血性腦梗塞）。血栓形成及其并發(fā)癥已成為世界范圍內(nèi)致殘率和致死率最高的疾病之一。血栓栓塞性疾病是一種多因素性疾病，遺傳性易栓背景及獲得性易栓因素均在其發(fā)病中發(fā)揮著不可或缺的作用。盡管目前已有很多基因變異導致的凝血或抗凝蛋白功能失調(diào)被認為與血栓形成具有關聯(lián)，但仍有許多血栓患者的遺傳背景不能被目前已知的遺傳性易栓背

2、景所解釋，故而探索新的可能與血栓形成相關的基因變異顯得尤為重要。近來有研究表明，β2GPI是體內(nèi)一種天然的抗凝蛋白，主要通過抑制凝血酶的凝血活性但不影響凝血酶對蛋白C的激活而發(fā)揮抗凝作用。
　　目的：β2GPI編碼基因為APOH，本研究以APOH基因作為候選基因，研究其多態(tài)性是否與為中國人群血栓栓塞性疾病的危險因素；并進一步探索APOH基因多態(tài)性導致β2GPI下降及血栓形成的具體機制。
　　方法：選擇26例狼瘡抗凝物質(zhì)陽性的

3、患者，通過對其APOH基因的8個外顯子及其剪接位點、3端及5端非翻譯區(qū)進行PCR后直接測序的方法查找基因變異；隨機挑選60例靜脈血栓患者,缺血性腦梗塞患者及正常對照組DNA進行測序驗證第一步所發(fā)現(xiàn)的基因變異，并大致評估其對疾病形成的風險；用Haploview4.0軟件行基因變異的連鎖不平衡分析；進一步擴大樣本量行病例對照研究（1304例VTE vs1334例正常組；1444例IS vs1334例正常組）評估基因變異對血栓形成的風險比；挑

4、選各類型血漿行Western blot及ELISA行β2GPI抗原水平檢測及凝血功能試驗（凝血酶原時間及凝血酶生成實驗）；體外重組野生型及突變型APOH表達質(zhì)粒行細胞實驗，檢測基因變異對β2GPI的表達及凝血功能的影響。
　　結(jié)果：在26例狼瘡抗凝物陽性的患者中主要發(fā)現(xiàn)了四個基因多態(tài)性，c.1004G>C、c.461G>A、c.422T>C、c.-32C>A，結(jié)果顯示這4種APOH基因多態(tài)性完全連鎖不平衡（D’=1，r2=1），選

5、用 c.461G>A作為限制性內(nèi)切酶酶切代表，形成三種單倍型 H1(CTGG/CTGG),H2(CTGG/ACAC)及 H3(ACAC/ACAC)。酶切結(jié)果顯示 H2，H3單倍型對靜脈血栓形成的優(yōu)勢比為1.5和7，而其對動脈血栓形成作用不大。血漿實驗發(fā)現(xiàn)，H2，H3單倍型血漿β2GPI蛋白減少，凝血酶原時間縮短，凝血酶生成增多。
　　細胞實驗證實 c.-32C>A造成 APOH基因的表達水平下降，導致細胞內(nèi)外β2GPI蛋白均減少。