TIM-3-TIM-3L通路在天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)中的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究TGF-β1對(duì)同種反應(yīng)性T細(xì)胞增殖能力及CD25表達(dá)水平的影響。
　　 方法：以絲裂霉素處理的Balb/C(H-2d)裸鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，CFDA-SE標(biāo)記的C57BL/6(H-2b)小鼠的T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocytes culture，MLC)。分別設(shè)立對(duì)照組(TGF-β1 0ng/ml)、低濃度組(TGF-β1 1.0ng/ml)、中等濃度組(TG

2、F-β1 5.0ng/ml)和高濃度組(TGF-β1 10.0ng/ml)。MLC結(jié)束后利用Alamar Blue法檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)CD3、CD25表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)立IL-2組(TGF-β1 5.0ng/ml+外源性IL-2 100u/ml)，以觀測(cè)其對(duì)TGF-β1生物學(xué)效應(yīng)的影響。
　　 結(jié)果：TGF-β1可明顯降低同種抗原活化T細(xì)胞的增殖反應(yīng)強(qiáng)度(對(duì)照組 vs 低濃度組，p<0.05)，而且隨著

3、TGF-β1劑量加大，免疫抑制能力增強(qiáng)(低濃度組 vs 中濃度組，p<0.05)。TGF-β1在抑制T細(xì)胞增殖的同時(shí)，也使得CD25+T細(xì)胞比例上調(diào)(對(duì)照組 vs 低濃度組，p<0.05)，但并無(wú)明顯的劑量依耐性。加入外源性IL-2后，T細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(IL-2組 vs 中濃度組，p<0.05)，同時(shí)CD25+T細(xì)胞比例降低(IL-2組 vs 中濃度組，p<0.05)。
　　 結(jié)論：TGF-β1可明顯抑制同種抗原活化T細(xì)胞的增

4、殖，并使CD25+T細(xì)胞表達(dá)增加，而外源性IL-2則可逆轉(zhuǎn)TGF-β1的免疫抑制功能，下調(diào)CD25+T細(xì)胞比例，說(shuō)明TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)要受到外源性IL-2的影響。
　　 第二部分
　　 目的：研究TGF-β1誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的能力及其相關(guān)機(jī)理。
　　 方法：1、利用絲裂霉素處理的Balb/C裸鼠脾細(xì)胞刺激C57BL/6小鼠T細(xì)胞，同時(shí)給予TGF-β1予以干預(yù)(按TGF-β1劑量不同設(shè)立

5、4組：對(duì)照組，低濃度組，中濃度組和高濃度組)，共同培養(yǎng)5天后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞比例；同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)水平。2、在第一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)MACS分離獲取C57BL/6小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞，用同種抗原刺激后，給予TGF-β1干預(yù)，培養(yǎng)5天后分離CD4+CD25+T細(xì)胞，利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)其抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。
　　 結(jié)果：T細(xì)胞經(jīng)同種抗原刺激后，在中、高

6、濃度TGF-β1誘導(dǎo)下CD4+CD25+T細(xì)胞比例均明顯升高，F(xiàn)oxp3的表達(dá)水平也相應(yīng)增加，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)。TGF-β1可直接誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的CD4+CD25+T細(xì)胞能有效抑制淋巴細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論：TGF-β1可誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg，促進(jìn)其表達(dá)Foxp3，并能抑制淋巴細(xì)胞增殖。
　　 第三部分

7、r>　　 目的：利用TGF-β1體外誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，通過(guò)體內(nèi)輸注延長(zhǎng)小鼠皮膚移植物存活時(shí)間，并研究其相關(guān)機(jī)理。
　　 方法：根據(jù)誘導(dǎo)條件不同分為三組：對(duì)照組(加入IL-2培養(yǎng)的C57BL/6小鼠T細(xì)胞)、MLR組(經(jīng)同種抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T細(xì)胞)和TGF-β組(經(jīng)同種抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T細(xì)胞，同時(shí)加入5.0ng/ml TGF-β1誘導(dǎo))。利用FACS檢測(cè)CD4+CD25+T

8、細(xì)胞比例，并用RT-PCR檢測(cè)Foxp3的表達(dá)水平。建立小鼠皮膚移植模型，并于0、1、2和3d輸注上述細(xì)胞，觀察皮膚移植物存活時(shí)間。術(shù)后第9天，取部分受鼠行移植物病理檢測(cè)，用FACS檢測(cè)脾臟中Th1、Th2和CD4+CD25+Treg比例，并用Alamar Blue法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　 結(jié)果：TGF-β組中CD4+CD25+T細(xì)胞比例高于對(duì)照組和MLR組(p<0.05)，且其高表達(dá)Foxp3。將培養(yǎng)的細(xì)胞輸注給受鼠后發(fā)

9、現(xiàn)，輸注MLR組細(xì)胞的受鼠其移植物平均存活時(shí)間(mean survival time，MST)為(9.4±1.3)d，低于對(duì)照組(p<0.05)；而輸注TGF-β組細(xì)胞小鼠MST為(22.8±1.9)d，較對(duì)照組和MLR組明顯延長(zhǎng)(p<0.05)。病理檢測(cè)亦顯示TGF-β組受鼠移植物結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。FACS結(jié)果顯示TGF-β組小鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞(CD4+TIM-3+)比例低于對(duì)照組和MLR組(p<0.05)，而Th2細(xì)胞(

10、CD4+TIM-1+)比例則與MLR組類(lèi)似(p>0.05)，但低于對(duì)照組(p<0.05)；而且TGF-β組中CD4+CD25+Treg比例明顯高于對(duì)照組和MLR組(p<0.05)。用Alamar Blue法檢測(cè)受鼠外周淋巴細(xì)胞增殖活性顯示，TGF-β組受鼠淋巴細(xì)胞增殖能力被明顯抑制，低于對(duì)照組(p<0.05)。
　　 結(jié)論：TGF-β1可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為具有抑制能力的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼輸注可使小鼠體內(nèi)CD4+C

11、D25+Treg比例升高，同時(shí)抑制Th1和Th2細(xì)胞分化擴(kuò)增，并使得外周淋巴細(xì)胞增殖能力減弱，從而延長(zhǎng)小鼠皮膚移植物存活時(shí)間。
　　 第四部分
　　 目的：研究TIM-3-TIM-3L通路在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)中的作用。
　　 方法：用MACS從成年C57BL/6分離獲取天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural Treg，nTreg)，并利用TGF-β1誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞分化為誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced

12、Treg，iTreg)，隨后通過(guò)RT-PCR檢測(cè)其表達(dá)Foxp3和TIM-3L的水平，及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制能力。使用TIM-3融合蛋白(TIM-3.Ig)和anti-TIM-3處理nTreg和iTreg，對(duì)TIM-3-TIM-3L通路進(jìn)行阻斷，隨后利用MLC體系檢測(cè)其免疫抑制能力的變化情況。
　　 結(jié)果：分離獲取的nTreg和iTreg均可表達(dá)Foxp3。TIM-3L(galectin-9)在脾細(xì)胞高表達(dá)，同時(shí)在nTreg和

13、iTreg也檢測(cè)到有g(shù)alectin-9表達(dá)，但表達(dá)水平低于脾細(xì)胞(p<0.05)。用TIM-3.Ig對(duì)nTreg和iTreg進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，nTreg和iTreg抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力部分減弱，與未干預(yù)組差異顯著(p<0.05)，但nTreg和iTreg之間無(wú)差異(p>0.05)；而用anti-TIM-3處理nTreg和iTreg后并未明顯減弱其抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力(p>0.05)。
　　 結(jié)論：TGF-β1可誘導(dǎo)iTreg