調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性T細(xì)胞在膽道閉鎖小鼠免疫炎癥發(fā)展中的作用及影響.pdf

1、目的：研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和效應(yīng)性Th17細(xì)胞（Th17）在膽道閉鎖（BA）小鼠免疫炎癥發(fā)展中的作用；并過(guò)繼輸注Treg細(xì)胞或注射IL-17中和抗體，進(jìn)一步明確Treg/Th17細(xì)胞在膽道閉鎖免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：利用RRV建立膽道閉鎖小鼠模型，新生Balb/c小鼠隨機(jī)分為以下四組：1，正常組：出生后24h內(nèi)腹腔注射生理鹽水；2，輪狀病毒組：出生后24h內(nèi)腹腔注射RRV；3，Treg細(xì)胞組：出生后12h內(nèi)腹腔

2、過(guò)繼輸注Treg細(xì)胞，隨后12h內(nèi)注射RRV；4，IL-17抗體組：出生后12h內(nèi)注射RRV，隨后連續(xù)兩天注射不同劑量（15μg，30μg，50μg）IL-17中和抗體。觀察各組小鼠在不同時(shí)期的表型及組織病理學(xué)等變化；利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和Western blot分別檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中Foxp3，IL-17A以及ROR-γt基因和蛋白表達(dá)；利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中CD4+細(xì)胞、Foxp3+Treg細(xì)胞及

3、IL-17+Th17細(xì)胞表達(dá)部位及變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞比例變化。利用ELISA檢測(cè)小鼠肝臟組織中炎性細(xì)胞因子變化，以及肝臟組織DC細(xì)胞的TLRs表達(dá)情況。分離DC細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6表達(dá)區(qū)別。體外利用細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察 Treg細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制作用，觀察膽道閉鎖小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞抑制功能的變化。
　　結(jié)果：正常組23只，3天

4、內(nèi)死亡1只，無(wú)1例出現(xiàn)發(fā)育遲緩和膽汁淤積癥狀，其余小鼠均健康存活到21天。24只輪狀病毒組小鼠中發(fā)生膽道閉鎖的有18只（75.0％），以發(fā)育遲緩（體重增長(zhǎng)緩慢或停滯）和膽汁淤積（無(wú)毛區(qū)皮膚黃染，大便陶土樣）為主要癥狀；肝臟大體觀見(jiàn)淤膽明顯，表面顆粒狀，肝外膽管呈索條狀，膽囊顯示不清；肝臟及膽管組織切片HE染色可見(jiàn)肝外膽管閉鎖，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。膽道閉鎖小鼠肝臟組織中Foxp3，IL-17和ROR-γt基因及蛋白表達(dá)均明顯高于正常組

5、，在第7天達(dá)到峰值；免疫組織化學(xué)顯示膽道閉鎖小鼠肝臟組織尤其是匯管區(qū)中CD4+細(xì)胞、Foxp3+Treg細(xì)胞及IL-17+Th17細(xì)胞均顯著增加；流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖小鼠肝臟組織中Treg細(xì)胞比例降低，而Th17細(xì)胞比例升高；膽道閉鎖小鼠肝臟組織中IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β1、IL-10，IL-17，IL-12、IL-23、IFN-γ和IL-6均高于正常對(duì)照組。膽道閉鎖小鼠肝臟DC細(xì)胞中TLR3、7、8基因和蛋白均高于正

6、常對(duì)照組。膽道閉鎖小鼠肝臟DC細(xì)胞中IL-6明顯高于正常對(duì)照組，而CD4+T細(xì)胞中IL-6分泌無(wú)明顯差異。細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞能抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生，而膽道閉鎖小鼠中Treg細(xì)胞抑制功能降低。過(guò)繼輸注Treg細(xì)胞后，小鼠膽道閉鎖發(fā)生率降低到23.1％，肝臟炎性表現(xiàn)明顯減輕，小鼠生存期延長(zhǎng)，肝臟組織中Th17細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白較膽道閉鎖小鼠明顯降低，免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17+細(xì)胞表達(dá)減少，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)肝臟組織中Th17細(xì)胞比

7、例降低（P<0.05）；注射不同劑量IL-17中和抗體后，小鼠膽道閉鎖發(fā)生率均有不同程度降低，以注射50μg抗體組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且肝臟組織尤其是匯管區(qū)炎性表現(xiàn)減輕，伴隨有小鼠生存期延長(zhǎng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)注射50μg IL-17抗體組的小鼠肝臟組織中IL-17+蛋白較病毒組明顯減少（P<0.05），而免疫組化發(fā)現(xiàn)肝臟組織匯管區(qū)IL-17+細(xì)胞表達(dá)較病毒組明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.病毒感染后，引起肝臟微

8、環(huán)境改變以及TLRs依賴的DC細(xì)胞等變化，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞減少及功能降低，而Th17細(xì)胞增多，二者失衡在膽道閉鎖膽管損傷的進(jìn)行性炎癥中發(fā)揮著重要作用。
　　2.過(guò)繼輸注Treg細(xì)胞后能明顯改善小鼠膽道閉鎖表型，延長(zhǎng)生存期，減輕體內(nèi)炎癥表現(xiàn)，表明Treg細(xì)胞對(duì)病毒感染后的炎性反應(yīng)起抑制作用，為膽道閉鎖的防治提出了可能。
　　3.通過(guò)注射IL-17中和抗體，可以達(dá)到使小鼠膽道閉鎖表型降低，生存期延長(zhǎng)的目的，減輕體內(nèi)炎