氟西汀長期給藥后活體動物腦內特異性基因的表達和編輯及在慢性應激快感缺失后基因表達的改變.pdf

1、目的：
　　氟西汀作為一種五羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)，一方面能夠抑制五羥色胺的再吸收，提高突觸間隙中五羥色胺的濃度，另一方面可以結合并激活5-HT2B受體，引起細胞內部鈣離子濃度增加，激活鋅依賴性的金屬蛋白酶(MMPs)，導致某些生長因子釋放，比如表皮生長因子HB-EGF的釋放。近年來人們比較關注于氟西汀對行為學相關基因的影響，這些與行為學相關的基因包括:5-HT2受體，其中包括5-HT2B(Htr2b)和5-HT2C(Ht

2、r2c);編碼cPLA磷脂酶基因cpla2，其中包括cPLA2a(Pla2g4a);還有編碼GluK2的海藻氨酸鹽受體基因Grik2和編碼GluK4的海藻氨酸鹽受體基因Grik4。
　　RNA腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminases acting in RNA，ADARs）是一種酶家族，可將某些mRNA腺嘌呤核苷去氨基酸轉化為次黃嘌呤核苷，即A-to-I轉換。ADARs可編輯5-HT2受體和GluK2的mRNA表達。

3、
　　熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)的方法可根據(jù)細胞特異性標記物分選出新鮮分離轉基因鼠的星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞，通過這一方法可以進一步驗證我們之前在原代細胞培養(yǎng)和整體動物中的結果，另一方面也可以克服原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞不能進行氟西汀慢性處理的缺點。
　　動物模型的建立對于了解應激誘導的行為學改變的病理生理及形成有效的治療方案來說極其重要。理想的慢性應激動物

4、模型能夠復制出應激應答的各個方面并能夠模擬疾病的發(fā)生。我們研究組建立了小鼠的抑郁模型，快感缺失是抑郁的主要特征，通過糖水攝取試驗檢測快感缺失?？梢匝芯糠魍旄腥笔∈竽X內細胞上述基因mRNA表達，這使得人們研究氟西汀對抑郁癥又進了一步。
　　方法：
　　建立轉基因小鼠的抑郁模型，應用real-time PCR檢測小鼠在慢性應激刺激快感缺失情況下的5-HT2B受體，5-HT2C受體，cPLA2a，ADAR2，GluK2及G

5、luK4基因的表達。氟西?。?0 mg/kg）腹腔注射轉基因小鼠，觀察氟西汀和（或）慢性應激快感缺失對星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞5-HT2B受體，5-HT2C受體，cPLA2，ADAR2，GluK2及GluK4基因表達的影響。并且，經(jīng)PCR測序研究氟西汀對5-HT2B受體與GluK2 RNA編輯的影響。使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組資料用one-way ANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　

6、結果：
　　1、Cfos和fosB mRNA表達
　　氟西汀10 mg/Kg腹腔注射2小時后取腦，觀察氟西汀對極早基因cfos和fosB表達的影響。在星形膠質細胞和神經(jīng)元細胞中，cfos和fosB mRNA表達上調。
　　2、五羥色胺轉載體mRNA表達
　　五羥色胺轉載體在整體動物的星形膠質細胞中沒有表達，這與之前我們在原代星形膠質細胞中得出的結果一致。
　　3、慢性應激誘導快感缺失轉基因小鼠基因表達

7、>　　(1)5-HT2B受體mRNA水平
　　在正常組轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有5-HT2B受體表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉基因動物組星形膠質細胞中5-HT2B受體表達水平顯著上調(P＜0.01)。而在慢性應激刺激快感缺失組轉基因小鼠中，星形膠質細胞5-HT2B受體表達水平是顯著下降的(P＜0.01)，經(jīng)氟西汀慢性處理(2周)的快感缺失組轉基因小鼠5-HT2B受體表達水平顯著上升(P＜0.05)，并與未經(jīng)

8、氟西汀處理的正常組轉基因小鼠星形膠質細胞5-HT2B受體表達水平無顯著差異。神經(jīng)元細胞5-HT2B受體表達水平未受到氟西汀長期給藥及慢性應激處理后快感缺失的影響。
　　(2)5-HT2C受體mRNA水平
　　在正常轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有5-HT2C受體表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉基因動物神經(jīng)元細胞5-HT2C受體表達水平顯著上調(P＜0.01)。經(jīng)慢性應激刺激快感缺失組轉基因小鼠神經(jīng)元細胞較正常

9、組轉基因小鼠神經(jīng)元細胞5-HT2C受體表達水平相比無顯著性改變，而經(jīng)氟西汀慢性處理后快感缺失組轉基因小鼠神經(jīng)元細胞5-HT2C受體表達水平顯著上升(P＜0.01)，并與經(jīng)氟西汀處理的正常組轉基因小鼠神經(jīng)元細胞5-HT2C受體表達水平無顯著差異。即5-HT2C受體表達未受慢性應激處理后快感缺失的影響。星形膠質細胞5-HT2C受體表達未受到氟西汀長期給藥及慢性應激處理后快感缺失的影響。
　　(3) cPLA2a mRNA表達水平

10、>　　在正常轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有cPLA2a受體表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，在正常組轉基因動物星形膠質細胞中cPLA2a表達水平顯著上調(P＜0.01)。慢性應激刺激后快感缺失組轉基因小鼠星形膠質細胞cPLA2a表達水平較正常組轉基因鼠表達顯著下降(P＜0.01)，而在經(jīng)氟西汀慢性處理后快感缺失組轉基因小鼠星形膠質細胞cPLA2a表達水平顯著上升(P＜0.05)，并與正常組轉基因小鼠星形膠質細胞cPLA2a表達水

11、平無顯著差異。轉基因小鼠神經(jīng)元細胞cPLA2a表達水平均未受氟西汀長期給藥及慢性應激處理后快感缺失的影響。
　　(4) ADAR2 mRNA表達水平
　　在正常轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有ADAR2表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉基因動物星形膠質細胞中ADAR2表達水平顯著上調(P＜0.01)。經(jīng)慢性應激刺激后快感缺失組轉基因小鼠無論是否進行氟西汀慢性處理星形膠質細胞ADAR2表達水平均較正常組轉基因小鼠

12、ADAR2表達下降(P＜0.01)。神經(jīng)元細胞ADAR2表達水平未受到氟西汀長期給藥及慢性應激處理后快感缺失的影響。
　　(5) Gluk2 mRNA表達水平
　　在正常轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有Gluk2表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，在正常組轉基因動物星形膠質細胞Gluk2表達水平顯著上調(P＜0.01)。而經(jīng)慢性應激刺激后快感缺失組轉基因小鼠無論是否經(jīng)過氟西汀處理星形膠質細胞Gluk2表達水平均較正常組轉

13、基因小鼠相比無明顯變化。轉基因小鼠神經(jīng)元細胞Gluk2表達水平未受到氟西汀長期給藥及慢性應激處理后快感缺失的影響。
　　(6) Gluk4 mRNA表達水平
　　在正常轉基因小鼠中星形膠質細胞和神經(jīng)元中均有Gluk4表達。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉基因鼠神經(jīng)元細胞中Gluk4表達水平顯著上調(P＜0.01)。經(jīng)慢性應激刺激后快感缺失組轉基因小鼠，神經(jīng)元細胞Gluk4表達水平顯著下降(P＜0.01)，而經(jīng)氟西汀慢性處

14、理后快感缺失組轉基因小鼠Gluk4表達水平顯著上升(P＜0.05)，并與正常組轉基因小鼠神經(jīng)元細胞Gluk4表達水平無顯著差異。星形膠質細胞Gluk4表達水平未受到氟西汀長期給藥及慢性應激處理快感缺失的影響。
　　5、Gluk2 RNA編輯
　　轉基因小鼠經(jīng)流式細胞分選后分離出星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞，其PCR產(chǎn)物完成GluK2的基因測序。GluK2的3個編輯位點（I/V, Y/C和Q/R）可通過測序得到的校正曲線來計算其編

15、輯水平。結果如圖所示。編輯的(V，C，R)和未編輯的(I，Y，Q)的GluK2 PCR產(chǎn)物（上海生工）按100∶0（100％編輯），90∶10，80∶20，70∶30，60∶40比例得出GluK2 RNA編輯的校正曲線，正常對照組和氟西汀腹腔注射組可通過該校正曲線得到星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞相應的GluK2 G/G+A比率。結果得出，在正常對照組，星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞I/V位點編輯比率大約為84％，Y/C位點編輯比率為82％，Q/R

16、位點的編輯比率為82％。在氟西汀處理2周的整體動物中，在神經(jīng)元細胞3個位點的編輯比率沒有發(fā)生變化，而在星形膠質細胞中I/V位點編輯比率大約為92％，Y/C位點編輯比率為89％，Q/R位點的編輯比率為90％。這提示氟西汀誘導了星形膠質細胞GluK2的mRNA編輯。
　　6、5-HT2B受體RNA編輯
　　在神經(jīng)元細胞中，無論氟西汀處理與否，測序結果提示5-HT2B受體的8個編輯位點均未編輯，而在星形膠質細胞中，對照組未經(jīng)處理的