HMGN2的亞細(xì)胞定位及其重組免疫毒素的研究.pdf

1、Y9 9 5 2 7 3作專學(xué)校代碼：1 0 6 1o學(xué) 號(hào)；B 們4 5 8四川I 大學(xué)博士學(xué)位論文題目：叢叢g 盟2 曲堊鲴照定僮盈墓重塑魚痤垂塞鮑班塞者 熊文碧業(yè) 病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師姓名 王伯瑤教授二O O 五年十一月二十七日摘 要著色。用兩種抗體行E L I S A 分析在細(xì)胞培養(yǎng)上清亦檢測(cè)到H M G N 2 。激光共聚焦顯微鏡下觀察p E G F P - N I ．H M G N 2 轉(zhuǎn)染的H e l a 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)綠

2、色熒光主要在核內(nèi)，但核外也同樣存在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明H M G N 2 生物合成后不僅定位于細(xì)胞核中，而且分布于細(xì)胞漿，亦可分泌到細(xì)胞外。第三部分以H M G N 2 的a ．螺旋結(jié)構(gòu)域與假單胞菌外毒素( P s e u d o m o n a se x o t o x i n ，P E ) 的截短和修飾形式P E 3 8 P K D E L D o m a i n l l I 耦連構(gòu)建重組免疫毒素原核表達(dá)質(zhì)粒p E T - 3 2 a

3、／H M G N 2 o ．P E I I I ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株B L 2 1 ( D E 3 ) 通過(guò)I P l B 誘導(dǎo)其表達(dá)。采用鎳離子螫合層析法純化重組蛋白，并用凝血酶酶切去標(biāo)簽蛋白。采用F I T C 標(biāo)記的重組免疫毒素，在熒光顯微鏡下觀察到重組免疫毒素H M G N 2 o ．P E I I I 易于進(jìn)入到H e l a 細(xì)胞，但進(jìn)入正常人宮頸上皮細(xì)胞中則極少；以M T T 法檢測(cè)重組免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷活性，結(jié)果

4、表明該重組免疫毒素對(duì)H e l a 細(xì)胞具有特異性殺傷活性，其半數(shù)抑制濃度( I C 5 0 ) 約為1 2 ．8 6 n咖l ，而對(duì)人正常宮頸上皮細(xì)胞毒性較?。籇 N A 結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明重組免疫毒素與H e l a 細(xì)胞D N A 具有較強(qiáng)的親和力，重組免疫毒素在l ：8 比例下就可以和H e l a 細(xì)胞D N A 結(jié)合，阻滯D N A 在瓊脂糖電泳中泳動(dòng)。說(shuō)明重組免疫毒素能選擇性地與H e l a細(xì)胞基因組D N A 結(jié)合，提示重組

5、免疫毒素H M G N 2 a ．P E I I I 可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程而損傷其蛋白質(zhì)等大分子的生物合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)顯示，隔日1 2 m g ／k g 的重組免疫毒素，總共給藥三次，能明顯抑制荷H e l a 細(xì)胞瘤的裸鼠瘤組織的生長(zhǎng)，在顯微鏡下，可見(jiàn)瘤組織出現(xiàn)明顯壞死，并且高倍鏡下，還可看出，瘤組織凋亡細(xì)胞明顯增多。本實(shí)驗(yàn)在體外和體內(nèi)抑瘤檢測(cè)系統(tǒng)均證明重組免疫毒素H M G N 2 Q