眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素-白介素4受體單抗免疫毒素的制備及其抗胰腺癌作用.pdf

1、免疫毒素(Immuonotoxin，IT)是由能與腫瘤細(xì)胞表面受體或細(xì)胞表面靶抗原特異結(jié)合的單克隆抗體和對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的毒素分子通過化學(xué)交聯(lián)構(gòu)建而成。 細(xì)胞毒素(Cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒中一類重要的活性蛋白，約占蛇毒總蛋白量的40％，由60-63個(gè)氨基酸殘基組成，分子量在7000Da左右，國內(nèi)外許多報(bào)道都證實(shí)其具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。 白介素.4受體(IL4R)已被發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞表面高表達(dá)，但是在正

2、常胰腺組織和人肺癌細(xì)胞H1299則不表達(dá)或者低表達(dá)，目前以IL4R作為靶點(diǎn)的免疫毒素研究已取得一系列令人鼓舞的結(jié)果。為探索細(xì)胞毒素是否能與抗IL-4R單克隆抗體(Monoclonal antibody of IL-4receptor,MAILAR)偶聯(lián)構(gòu)建成免疫毒素，以選擇性殺傷高表達(dá)IL-4R的胰腺癌細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)擬從眼鏡蛇毒中分離出CTX，將CTX與MAILAR進(jìn)行了偶聯(lián)，并觀察和比較偶聯(lián)物對(duì)胰腺導(dǎo)管上皮癌PANC-1細(xì)胞，原位胰腺癌

3、BXPC-3細(xì)胞和肺腺癌H1299細(xì)胞的作用，為尋找胰腺癌治療新方法提供實(shí)驗(yàn)資料。 1.CTX的分離純化眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)過SP-Sepharose FF陽離子交換色譜，獲得13個(gè)蛋白質(zhì)組分。其中組分XI使大鼠離體心臟標(biāo)本收縮張力增加、幅度縮小、最后停于收縮期，呈現(xiàn)明顯的心臟毒性；同時(shí)對(duì)分別刺激大鼠膈肌和膈神經(jīng)引起的收縮均有抑制作用，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用，鑒定為眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素(CTX)組分。將XI組分過Sephasi 1 Pep

4、tide C18柱精細(xì)純化，經(jīng)SDS-PAGE(Tris-Tricine系統(tǒng))鑒定，CTX-XI呈均一蛋白區(qū)帶；分子量為7235Da左右。自動(dòng)電位滴定法測定PLA2，活力為0，得到CTX純品暫命名為CTX-XI。 2.免疫毒素MAILAR-CTX偶聯(lián)物的制備將CTX和MAILAR用N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)法進(jìn)行偶聯(lián)，構(gòu)建CTX和MAIL4R的偶聯(lián)物，偶聯(lián)物MAIL4R-CTX在SDS-PAGE中為一條

5、分子量大于100kD的單一條帶，還原后則可見為兩條帶；該偶聯(lián)物既能與抗眼鏡蛇毒血清產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原一抗體反應(yīng)，也能直接與羊抗小鼠的抗體產(chǎn)生反應(yīng)：與該偶聯(lián)物共同孵育的人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞被染成棕色，而不表達(dá)IL-4R的人肺腺癌H1299細(xì)胞未被染色，表明偶聯(lián)物與人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞具有很好的結(jié)合性，而與人肺癌H1299細(xì)胞不結(jié)合。 3.CTX、MAILAR和MAILAR-CTX體外抗腫瘤活性采用MTT法觀察CTX、MAILA

6、R和CTX-MAILAR對(duì)體外培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞，BXPC-3細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的抑制作用，并測定其半數(shù)抑制濃度(IC50)。CTX對(duì)PANC-1，BXPC-3和H1299細(xì)胞均有快速的殺傷作用，CTX濃度為8μg/ml時(shí)，對(duì)PANC-1，BXPC-3和H1299細(xì)胞4h殺傷率分別為89.8％、88.0％和89.3％，對(duì)3株細(xì)胞的殺傷強(qiáng)度沒有明顯的區(qū)別；MAILAR對(duì)上述細(xì)胞明顯無殺傷作用；MAILAR-CTX濃度為9.4μg