廣西眼鏡蛇毒細胞毒素-4N的分離純化及其對HSC-T6細胞ERK信號通路的影響.pdf

1、目的:為了獲得高純度的眼鏡蛇毒細胞毒素-4N(CTX-4N)，探索眼鏡蛇毒中細胞毒素-4N對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)的增殖抑制作用和CTX-4N通過ERK信號通路對HSC-T6細胞凋亡的影響，從而闡明CTX-4N通過ERK信號通路誘導肝星狀細胞凋亡的機制。
　　方法:采用DEAE-Sepha roseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱結(jié)合的方法對眼鏡蛇毒

2、蛋白進行分離純化。采用HSC-T6增殖抑制實驗對每一步分離后的各峰蛋白CTX-4N進行活性檢測。收集活性最強的蛋白峰，在用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定其純度。采用蛋白質(zhì)譜法鑒定其成分及分子量大小。用CCK-8方法檢測不同濃度的CTX-4N對HSC-T6的增殖抑制作用。采用流式細胞術檢測CTX-4N對HSC-T6細胞凋亡的影響。采用Western-Blot檢測CTX4-N作用HSC-T6細胞不同時間后，ERK信號通路中ERK1/2的磷酸化水平的

3、變化;以及在加入抑制劑PD98059處理HSC-T6細胞后，ERK信號通路中ERK1/2磷酸化水平的變化。抑制劑實驗分組:空白對照組、CTX-4N組、抑制劑組和CTX-4N+抑制劑組。
　　結(jié)果:通過DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep HighS陽離子交換柱分離純化后得到一個電泳純度的蛋白，蛋白質(zhì)譜鑒定為CTX-4N，分子量約為9.605 KDa。不同濃度的

4、CTX-4N對HSC-T6細胞具有增殖抑制作用，隨著濃度的增加而增強，最小抑制濃度為2μg/mL，呈劑量-效應關系，IC50為(12.836±0.045)μg/mL。不同濃度的CTX-4N對HSC-T6細胞的凋亡作用隨著濃度的增加而增強，且誘導HSC-T6凋亡的最小濃度為4μg/mL。以4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6不同時間后，各時間點的ERK1/2蛋白表達沒有變化，而磷酸化ERK1/2蛋白的表達一開始是隨著作用時間的延長而

5、表達增加，作用10min后磷酸化ERK1/2表達水平最高，隨后就開始降低，到60min后其表達低于對照組。以10μ mol/L的PD98059和4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6細胞后，ERK1/2蛋白的表達沒有發(fā)生改變，而可以顯著的抑制磷酸化ERK1/2的表達。
　　結(jié)論:廣西眼鏡蛇毒通過DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱