鎘抑制卵母細胞MI期進程中MPF的活性及其相關(guān)基因的表達.pdf

1、目的：
　　通過觀察卵母細胞MI期即GV期至第一極體釋放進程中，不同劑量鎘暴露卵母細胞不同時間后，卵母細胞成熟促進因子（MPF）活性及其相關(guān)基因—Cdk1、Ccnb1、Cdc25b的變化，探討鎘是否通過改變MPF相關(guān)基因的表達調(diào)節(jié)MPF的活性，進而影響卵母細胞MI期的進程。
　　方法：
　　28日齡的清潔級ICR雌性小鼠腹腔注射PMSG10 IU/只，48小時后處死，取生發(fā)泡期卵母細胞于體外暴露鎘0 h、6 h、9 h

2、，鎘暴露劑量分別為0μM、0.05μM、0.5μM、2.5μM、5μM；用體視顯微鏡分別觀察0h、6h、9h各劑量組卵母細胞的形態(tài)學(xué)變化；分別收集0 h、6 h、9 h各劑量組的卵母細胞，采用ELISA法檢測卵母細胞MPF活性；采用Real time-PCR方法和Western-blot法檢測各暴露時間點、各劑量組卵母細胞的Cdk1、Ccnb1、Cdc25b的mRNA及蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、鎘暴露小鼠卵母細胞

3、MI期進程中不同暴露劑量、不同暴露時間點的細胞形態(tài)觀察：0 h Cd組每個卵母細胞均可見清晰的細胞核，核大，外包完整的細胞膜，卵母細胞外包裹著層透明帶，此時的卵母細胞即為GV（Germinal vesicle）期的卵母細胞。對照組卵母細胞體外培養(yǎng)6h可見卵母細胞基本都發(fā)生了生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle breaking down，GVBD），個別細胞可見卵周隙（卵母細胞與透明帶之間的距離）變寬；對照組體外培養(yǎng)9 h可見卵

4、母細胞均已發(fā)生GVBD，少量細胞可見第一極體排出；0.05μM Cd組、0.5μM Cd組鎘暴露6h，均可見大量的卵母細胞發(fā)生GVBD，但仍有少量卵母細胞可見明顯的細胞核；2.5μM Cd組、5μM Cd組鎘暴露6 h較0.05μM Cd組、0.5μM Cd組有更多的卵母細胞可見明顯的細胞核；0.05μM Cd組、0.5μM Cd組、2.5μM Cd組、5μM Cd組鎘暴露9 h可見卵母細胞基本都已發(fā)生GVBD，但仍有個別卵母細胞可見細

5、胞核；其中，0.05μM Cd組、0.5μM Cd組可見少量卵母細胞卵周隙變寬。
　　2、鎘暴露小鼠卵母細胞MI期進程中對MPF活性的影響：（1）同一暴露劑量，不同暴露時間：0μM Cd組，隨著培養(yǎng)時間的延長MPF活性呈先上升后下降的趨勢；與0 h比較，MPF活性在6 h和9 h均上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；9 h與6 h比較MPF活性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；余各染毒劑量組，隨著鎘暴露時間的延長MP

6、F活性呈上升趨勢；與0 h比較，MPF活性在培養(yǎng)6 h和9 h均上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）同一暴露時間，不同暴露劑量：隨著染鎘劑量的增加，MPF的活性呈先上升后下降的趨勢；其中暴露6 h，0.05μM Cd組、0.5μM Cd組MPF活性高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；暴露9 h，各染毒組MPF活性均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；
　　3、鎘暴露小鼠卵母細胞MI期進程中對Cd

7、k1 mRNA及蛋白表達的影響：（1）同一暴露劑量，不同暴露時間：Cdk1 mRNA表達，0μM Cd組，9 h與0 h比較表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0.05μM Cd組和5μM Cd組，隨著鎘暴露時間的延長表達呈上升趨勢；與0h比較，在6h和9h表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0.5μM Cd組、2.5μM Cd組，Cdk1 mRNA在6 h表達下調(diào)，9 h表達又明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

8、.01）； CDK1蛋白表達，0μM Cd組，6 h和9 h與0h比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各染毒劑量組隨著鎘暴露時間的延長蛋白表達呈上升趨勢；與0h比較，各染毒組在6h和9 h蛋白表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）同一暴露時間，不同暴露劑量：①暴露6 h，Cdk1 mRNA表達，與對照組比較，0.05μM Cd組、5μM Cd組表達上調(diào)，0.5μM Cd組、2.5μM Cd組表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

9、義（P＜0.01）；CDK1蛋白表達，各染毒組隨著染鎘劑量的增加呈先上升后下降的趨勢，與對照組比較，各染毒組表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；②暴露9 h，各染毒組Cdk1 mRNA及蛋白表達隨著染毒劑量的增加呈先上升后下降的趨勢；與對照組比較，各染毒組mRAN及蛋白表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；
　　4、鎘暴露小鼠卵母細胞MI期進程中對Ccnb1 mRNA及蛋白表達的影響：（1）同一暴露劑量，不同

10、暴露時間：0μM Cd組，隨著培養(yǎng)時間的延長mRNA和蛋白表達呈先上升后下降的趨勢；與0 h比較，6 h和9 h mRAN和蛋白表達上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；9 h與6 h比較表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各染毒劑量組隨著鎘暴露時間點延長mRNA和蛋白表達呈上升的趨勢；與0 h比較，6 h和9 h表達上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）同一暴露時間，不同暴露劑量：①暴露6 h，Ccnb1

11、mRNA表達，與對照組比較，0.05μM Cd組、5μM Cd組表達均上調(diào)，0.5μM Cd組、2.5μM Cd組表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CCNB1蛋白表達，各染毒組隨著染毒劑量的增加呈先上升后下降的趨勢；與對照組比較，各染毒組表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；②暴露9 h，各染毒組Ccnb1 mRNA和蛋白表達隨著染毒劑量的增加呈先上升后下降的趨勢；與對照組比較，各染毒組表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

12、義（P＜0.01）；
　　5、鎘暴露小鼠卵母細胞MI期進程中對Cdc25b mRNA及蛋白表達的影響：（1）同一暴露劑量，不同暴露時間：各劑量組Cdc25b mRNA及蛋白表達隨著培養(yǎng)及染得時間的延長呈上升趨勢；與0h比較，6h和9h表達均上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）同一暴露時間，不同暴露劑量：①暴露6 h，Cdc25b mRNA表達，與對照組比較，0.05μM Cd組、5μM Cd組表達均上調(diào)，0.5μM

13、Cd組、2.5μM Cd組表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CDC25B蛋白表達，各染毒組隨著染毒劑量的增加呈先上升后下降的趨勢；與對照組比較，各染毒組表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；②暴露9 h，各染毒組Cdc25b mRNA和蛋白表達隨著染毒劑量的增加呈先上升后下降的趨勢；與對照組比較，各染毒組表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；
　　結(jié)論：
　　在本實驗條件下：
　　1、鎘