小鼠缺血再灌注腦損傷中Wnt-β-catenin信號通路相關因子的表達及其與海馬神經(jīng)發(fā)生的影響.pdf

1、目的：初步探討 Wnt/β-catenin相關因子在缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury，IRI）小鼠海馬中的表達規(guī)律及其對神經(jīng)干細胞的增殖作用。
　　方法：
　　1、將160只1月齡健康雄性昆明小鼠隨機分為正常組、假手術組、缺血再灌注后1d、3d、7d、14d、21d、28d組，通過夾閉小鼠雙側頸總動脈半小時再通的方法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。分別對模型小鼠進行神經(jīng)行為學、四肢協(xié)調性檢查，

2、同時運用 Y-型電迷宮檢測小鼠腦缺血再灌注后記憶能力，并采用 TTC染色觀察腦缺血再灌注后小鼠腦梗死情況；尼氏染色和透射電鏡觀察海馬區(qū)的形態(tài)結構變化；采用原位雜交法和免疫組織化學染色方法檢測Wnt/β-catenin信號通路重要信號分子Wnt1、Wnt3a、β-catenin、cyclinD1、GSK3β的表達變化。
　　2、將260只小鼠隨機分為正常組，IRI后1d、3d、7d、14d、21d、28d+海馬內注射生理鹽水組；缺血

3、再灌注后1d、3d、7d、14d、21d、28d+海馬內注射pβ-catenin組，每組20只。海馬內注射pβ-catenin組在模型建立后24h腦內注射pβ-cateninS33Y質粒。采用腹腔注射BrdU方法檢測海馬齒狀回區(qū)NSCs增殖規(guī)律及通過Western-Blot檢測不同時間點β-catenin、CyclinD1、GSK3β蛋白的表達水平；免疫組織化學染色觀察各時間點β-catenin、CyclinD1、GSK3β的表達變化。

4、
　　結果：
　　1、小鼠腦缺血再灌注損傷后與正常組、假手術組比較，在神經(jīng)行為學、協(xié)調性及學習記憶能力等方面均有明顯的缺失和障礙（P＜0.05），但隨著時間延長其有一定恢復。
　　2、形態(tài)學檢測：①TTC染色顯示正常組和假手術組腦組織無明顯梗死灶，IRI組腦組織中梗死灶明顯。②尼氏染色顯示：IRI組隨著灌注時間的增加，神經(jīng)細胞排列紊亂，核固縮，核溶解，顆粒細胞呈空泡樣變性，尼氏小體溶解、消失，以21天組最為嚴重。③透射

5、電鏡顯示IRI后7d組細胞內水腫，線粒體腫脹（空泡化，嵴斷裂），內質網(wǎng)和高爾基體擴張，核固縮，核膜間隙擴大。
　　3、免疫組織化學檢測：結果表明正常腦組織中β-catenin、cyclinD1表達均為陰性或弱陽性,GSK3β表達為陽性。IRI各組中β-catenin、cyclinD1陽性表達均顯著高于正常組和假手術組，7~14d陽性達高峰（P＜0.05）。IRI各組中GSK3β陽性細胞至缺血再灌注后21d表達升高（P＜0.05）。

6、IRI+NS各組β-catenin、CyclinD1陽性細胞數(shù)明顯多于正常組（P＜0.05），轉染質粒組β-catenin、CyclinD1陽性細胞數(shù)均多于未轉染組（P＜0.05），β-catenin以轉染后7d組最為顯著，CyclinD1在轉染后14d組最為顯著。IRI+NS組中GSK-3β陽性細胞數(shù)均低于正常組（P<0.01），轉染質粒組均低于未轉染組（P＜0.05），以轉染后14d組最為顯著。
　　4、wnt1、wnt3a原

7、位雜交檢測結果顯示，與正常組和假手術組比較，缺血再灌注各組均可見 wnt1、wnt3a陽性細胞，再灌注后1d表達開始增加，14d達高峰，28d減少至正常水平（P<0.05）。
　　5、BrdU檢測顯示與正常組比較，缺血再灌注后3d BrdU陽性細胞開始增高，7d達高峰（P＜0.05）。轉染質粒組BrdU陽性細胞數(shù)均多于未轉染組，以轉染后7d組最為顯著（P＜0.05）。6、Western-Blot結果表明，正常組可見GSK-3β蛋白

8、高表達，β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白低表達，轉染質粒組β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白表達升高，于轉染后7-14d表達量最高。轉染質粒組與正常組相比β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）；而轉染質粒組中GSK-3β蛋白表達卻均低于正常組（P<0.01），并隨轉染時間的延長而逐漸降低，轉染14d降至最低。
　　結論：
　　1.夾閉小鼠雙側頸總動脈的方法成功建立腦缺

9、血再灌注損傷的動物模型。
　　2.當Wnt/β-catenin途徑被激活時，wnt1、wnt3a有表達。
　　3.小鼠腦缺血再灌注損傷可激活Wnt信號通路，從而降低GSK3β的表達，促進β-catenin、cyclinD1在海馬齒狀回顆粒細胞層的表達。4.Wnt信號通路可能參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生。
　　5.小鼠海馬區(qū)注射、以脂質體介導的方法可成功進行小鼠腦內目的基因轉染。
　　6.小鼠腦缺血再灌注損傷可激發(fā)內