鯉Romo1基因的克隆、鑒定及其表達(dá)研究.pdf

1、活性氧調(diào)節(jié)基因Romo1是細(xì)胞內(nèi)一類重要的供氧因子，它位于線粒體上并通過線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ誘導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生。在生理?xiàng)l件下，Romo1維持細(xì)胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)水平來保持機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，同時(shí)促進(jìn)老化細(xì)胞和癌細(xì)胞的凋亡，并且通過調(diào)節(jié)P27基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖中起重要的作用，此外該基因是細(xì)胞周期從G1期到S期所必須的。因此，Romo1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存起重要的作用。在外源性刺激下，如無血清狀態(tài)和抗癌藥物的刺激時(shí)，Romo1基因的

2、表達(dá)量增加，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平以應(yīng)對(duì)外源性刺激反應(yīng)。
　　活性氧基團(tuán)(Reactive oxygen species，ROS）是一類具有活性的含氧化合物，它主要是有機(jī)體在有氧代謝中通過線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ產(chǎn)生的。細(xì)胞內(nèi)正常 ROS水平是在0.001μΜ和～0.7μΜ之間，過量的ROS通過抗氧化系統(tǒng)被除去進(jìn)而來維持氧化還原體內(nèi)平衡。ROS產(chǎn)量的失衡狀態(tài)會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)，會(huì)對(duì)細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞，引起DN

3、A破壞，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。盡管ROS存在許多負(fù)面效應(yīng)，但是適當(dāng)?shù)腞OS的水平在細(xì)胞生長(zhǎng)和生存中有重要作用，并且在參與固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗菌、消炎中具有重要意義。
　　近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于人類Romo1基因及其編碼蛋白的研究取得了初步成果，但是在硬骨魚中只在斑馬魚中有報(bào)道，在鯉魚中關(guān)于Romo1基因的研究至今沒有報(bào)道，并且雖然Romo1有多種功能，但是對(duì)于Romo1的免疫功能研究甚少，目前為止僅在七鰓鰻中研究過該基因的免疫功

4、能，在鯉魚中還未曾研究。
　　本研究首先對(duì)已報(bào)道的多個(gè)物種的Romo1基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物利用反轉(zhuǎn)錄PCR和RACE方法，首次克隆得到鯉魚（Cyprinus carpio.L）Romo1 cDNA全長(zhǎng)序列。鯉魚Romo1基因cDNA序列全長(zhǎng)為480bp,包含112bp的5，-非編碼區(qū)（5，-UTR），240bp的開放閱讀框（ORF）及128bp的3，-非編碼區(qū)（3，-URT）。其中鯉魚Romo1 mRNA的

5、ORF區(qū)編碼79個(gè)氨基酸。運(yùn)用Expasy的在線軟件Protparam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示Romo1蛋白質(zhì)的理論分子量為8.3198KDa；理論等電點(diǎn)為9.89；SMART預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)顯示在氨基酸序列的第23-45位具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在21-40位氨基酸處具有overlop環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其次用BioEdit7.0軟件，將鯉魚Romo1氨基酸序列與多個(gè)物種的Romo1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示鯉魚Romo1氨基酸序列與其他物

6、種的Romo1氨基酸序列同源性很高，在進(jìn)化上高度保守。運(yùn)用MEGA5.2軟件構(gòu)建各個(gè)物種Romo1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖9所示，鯉魚Romo1與青鱂Romo1相似度最高，親緣關(guān)系最近。通過進(jìn)一步的氨基酸序列一致性比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了克隆到的鯉魚活性氧調(diào)節(jié)基因 Romo1的進(jìn)化地位。
　　利用Real-time PCR方法分析了Romo1 mRNA在正常鯉魚肝、脾、鰓、頭腎、前腸、后腸、皮膚、肌肉、腦、性腺、口腔上皮11種組織中的表達(dá)差

7、異，結(jié)果分析得Romo1在鯉魚的體內(nèi)表達(dá)廣泛。
　　本研究利用魚類常見的致病菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）注射刺激鯉魚后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析注射刺激后不同的鯉魚免疫相關(guān)組織中的Romo1 mRNA在不同時(shí)間段的表達(dá)量變化狀況，初步研究鯉魚Romo1的免疫功能。結(jié)果顯示，Romo1 mRNA水平在鯉魚頭腎、肝臟、前腸、后腸、鰓中顯著上調(diào)。其中，免疫刺激后鯉魚 Romo1的表達(dá)量在前腸中升高最明顯，鰓