TRAF6在anti-β2GPI-β2GPI誘導THP-1細胞表達TF中的作用及機制初探.pdf

1、研究目的:
　　 本課題組前期研究揭示,Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)及其信號轉導途徑參與了抗磷脂抗體／抗原復合物(anti-beta-2-glycoproteinⅠ／beta-2-glycoproteinⅠ,anti—β2GPI／β2GPI)誘導人單核細胞株THP-1表達組織因子(tissue factor,TF)的過程,且部分依賴膜聯蛋白A2(Annexin A2,ANX2),成為抗磷脂

2、綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的機制之一。本論文重點探討TLR4引發(fā)的信號通路中的關鍵分子-腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6)在此過程中的作用及可能的調節(jié)機制。
　　 研究方法:
　　 (1)利用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-

3、qPCR)檢測anti-β2GPI／β2GPI誘導THP-1細胞TF mRNA的表達,采用TF活性測定試劑盒檢測細胞TF活性。
　　 (2)RT-qPCR、Western蛋白印跡、免疫共沉淀檢測anti-β2GPI／β2GPI誘導THP-1細胞表達TRAF6水平及其活化形式。
　　 (3)用蛋白酶體途徑抑制物-MG-132預處理THP-1細胞,觀察anti-β2GPI／β2GPI對THP-1細胞TRAF6和TF表達的影響

4、。
　　 (4)RT-qPCR、Western蛋白印跡檢測anti—β2GPI／β2GPI對TRAF6相關調控蛋白(TRAF4及鋅指蛋白A20)的表達。
　　 (5)利用本課題組已有的ANX2 RNA干擾慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1細胞、TLR4／MD-2途徑抑制物--紫杉醇(paclitaxel)以及白介素-1受體相關激酶1／4阻斷劑(IL-1 receptor-associatedkinase1／

5、4 inhibitor,IRAK1／4 inhibitor)預處理THP-1細胞,觀察對TRAF6、TRAF4及A20蛋白表達的影響。
　　 研究結果:
　　 (1)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)能夠刺激THP-1細胞表達TFmRNA及活性,與對照相比差異顯著(P<0.05)。
　　 (2)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)使THP-1細胞TRAF6 mRNA和蛋白(總蛋白

6、和泛素化的蛋白)表達均增加,并顯示時間相關性,分別在刺激15 min和30 min時表達至高峰。
　　 (3)MG-132(5μmol／L)明顯抑制anti—β2GPI／β2GPI對THP-1細胞TRAF6 mRNA和蛋白的刺激效應及TF的誘導表達。
　　 (4)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)刺激THP-1細胞后,TRAF4和A20 mRNA水平均增高,于刺激15 min達高峰。TRAF4蛋白表達在

7、30 min時達到高峰,后逐漸降低,而A20蛋白顯示逐漸升高,持續(xù)至12 h。
　　 (5)LV-RNAi-ANX2感染的THP-1細胞TRAF6蛋白表達降低,與未干擾相比差異顯著(P<0.05)；0.1μmol／L-1μmol／L紫杉醇能抑制TRAF6和TRAF4以及A20的刺激效應；不同濃度IRAK1／4 inhibitor可以干預TRAF6、TRAF4及A20蛋白的表達。
　　 結論:
　　 (1)單核細胞

8、株THP-1經anti-β2GPI／β2GPI刺激后,信號分子TRAF6被誘導表達并發(fā)生泛素化,最終促進細胞表達TF,從而參與APS血栓形成機制；MG-132可以干預TRAF6和TF的表達,為APS血栓形成的預防及治療提供新思路。
　　 (2)在anti-β2GPI／β2GPI誘導THP-1細胞表達TF所涉及的信號轉導通路中,TRAF6作為關鍵分子而發(fā)揮作用,ANX2、TLR4／MD-2、IRAKs為其上游信號分子,而TRAF4