FasL質(zhì)粒載體構(gòu)建及在小鼠心臟移植中抗排斥反應的研究.pdf

1、本課題構(gòu)建FasL真核表達質(zhì)粒載體，通過體外轉(zhuǎn)染供體小鼠骨髓源樹突狀細胞，探討誘導T淋巴細胞凋亡的機理。研究經(jīng)FasL轉(zhuǎn)染的供體來源的樹突狀細胞在小鼠心臟移植中對移植物的保護作用機制。并為進一步研究FasL基因在移植排斥中的保護作用打下基礎(chǔ)。 第一部分FasL基因真核表達載體的構(gòu)建目的構(gòu)建攜帶小鼠FasL基因的真核表達載體，為進一步基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞(Dendriticcell，DC)做準備。方法采用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、Not

2、Ⅰ雙酶切P43-FasL質(zhì)粒，將C57小鼠FasL基因切下后，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pTracer連接，連接產(chǎn)物在DH5α大腸桿菌中擴增，提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，并對陽性克隆的基因進行測序。結(jié)果酶切鑒定FasL基因成功正向插入pTracer質(zhì)粒載體，經(jīng)測序，克隆的基因與Genbank提供的C57小鼠FasL基因序列完全相同。結(jié)論以雙酶切法成功構(gòu)建pTracer質(zhì)粒為骨架的小鼠FasL真核表達載體，為深入研究FasL生物學功能奠定基礎(chǔ)

3、。 第二部分FasL轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細胞體外誘導T淋巴細胞凋亡的實驗研究目的制備穩(wěn)定表達FasL蛋白的小鼠骨髓源DC并探討其體外誘導T淋巴細胞凋亡的機理。方法采用培養(yǎng)基選擇法體外培養(yǎng)小鼠骨髓源DC，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染FasL基因至小鼠成熟DC，熒光實時定量PCR和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后FasLmRNA及蛋白的表達?；旌狭馨图毎囵B(yǎng)，MTT法檢測DC對T淋巴細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測誘導T淋巴細胞凋亡的能力。結(jié)果經(jīng)體外培養(yǎng)，每只小鼠可

4、獲1.5-2×107骨髓源DC，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FasL的DC較未轉(zhuǎn)染DC，F(xiàn)asLmRNA表達明顯升高，在未轉(zhuǎn)染DC，轉(zhuǎn)染pTracer質(zhì)粒DC和轉(zhuǎn)染pTracer-FasL質(zhì)粒的DC，F(xiàn)asL蛋白表達分別為5.59％，7.96％和35.77％?；旌狭馨图毎囵B(yǎng)結(jié)果顯示，F(xiàn)asL轉(zhuǎn)染后DC對T淋巴細胞刺激指數(shù)明顯下降(P＜0.01)，且誘導T淋巴細胞凋亡的能力明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論培養(yǎng)基選擇法可收獲大量骨髓源DC，具有典型形態(tài)，高

5、表達MHCⅡ和共刺激分子，所獲骨髓源DC能激活初始型T細胞免疫應答。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FasL基因至小鼠骨髓源DC，可以使DC高表達FasL蛋白。轉(zhuǎn)染FasL的DC體外刺激異系T淋巴細胞增殖的能力下降，且能明顯誘導T淋巴細胞凋亡。 第三部分FasL轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細胞輸注對心臟移植抗排斥反應的研究目的探討FasL轉(zhuǎn)染供體小鼠骨髓源DC后輸注對移植物的保護作用及抗排斥機理。方法建立小鼠異位心臟移植模型，術(shù)前7天靜脈輸注轉(zhuǎn)染FasL的DC，同

6、時設(shè)立異系對照組、CsA治療組、同系對照組、未轉(zhuǎn)染DC組。觀察各組移植心臟存活時間，評定術(shù)后7天移植物排斥反應病理分級。進一步，TdT介導的原位末端標記法(TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染FasL的DC、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒DC和未轉(zhuǎn)染DC誘導脾臟中T淋巴細胞凋亡。結(jié)果成功構(gòu)建穩(wěn)定的小鼠異位心臟移植模型。在轉(zhuǎn)染FasL的DC組中，移植心中位生存時間為22天，明顯長于異系對照組9天和未轉(zhuǎn)染DC組8天(P＜0.01)，排斥反應的病理分級也顯著低于異系對照組和未轉(zhuǎn)