RNAi沉默ERK1-2基因表達(dá)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,血管成形術(shù)是治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要方法。然而,血管成形術(shù)術(shù)后再狹窄發(fā)生率高,影響動(dòng)脈粥樣硬化的遠(yuǎn)期療效。研究已表明,血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化及血管成形術(shù)術(shù)后再狹窄的主要原因。本課題擬從基因治療的角度,以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)基因?yàn)榘悬c(diǎn),設(shè)計(jì)并篩選出針對(duì)ERK1/2基因的特異siRNA片段,利用脂質(zhì)體將其有效地轉(zhuǎn)染入大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi),誘導(dǎo)

2、ERK1/2基因沉默,旨在研究RNAi效應(yīng)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2基因表達(dá)的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,探討動(dòng)脈粥樣硬化及血管成形術(shù)術(shù)后再狹窄的治療新策略。
　　 方法：
　　 1、按照siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)出3條針對(duì)ERK1的siRNA序列和3條針對(duì)ERK2的siRNA序列,分別命名為ERK1-siRNA1、2、3和ERK2-siRNA1、2、3,并利用化學(xué)合成法合成上述序列。用脂質(zhì)體法將siRNA序列

3、轉(zhuǎn)染入大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi),每條序列設(shè)3種不同濃度,以空白組作對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48h后,用RT-qPCR法檢測(cè)各組ERK1/2 mRNA表達(dá)量的變化,計(jì)算siRNA序列的抑制率,從而篩選出最低轉(zhuǎn)染濃度、沉默效果最好的siRNA序列。
　　 2、將篩選出沉默效果最好的ERK1-siRNA1和ERK2-siRNA2轉(zhuǎn)染入大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi),以空白組、脂質(zhì)體組和陰性序列組作為對(duì)照;轉(zhuǎn)染48h后,用RT-qPCR法檢測(cè)各組ERK1/2 t

4、uRNA表達(dá)量的變化,Western blotting法檢測(cè)各組ERK1/2蛋白表達(dá)量的變化;在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,用MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、轉(zhuǎn)染48h后,RT-qPCR結(jié)果顯示,ERK1-siRNAl和ERK2-siRNA2在低轉(zhuǎn)染濃度組中的抑制效率最高,分別為95.77％和93.23%。
　　 2、將篩選出的siRNA序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48h后,RT-qPCR結(jié)果顯示,ER

5、K1-siRNA1和ERK1-siRNA1+ERK2-siRNA2組的ERK1 mRNA表達(dá)量明顯下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ERK2-siRNA2和ERK1-siRNA1+ERK2-siRNA2組的ERK2 mRNA表達(dá)量明顯下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、Western blotting結(jié)果顯示,ERK1-siRNA1、ERK2-siRNA2和ERK1-siRNA1+E

6、RK2-siRNA2組的ERK1/2蛋白表達(dá)相對(duì)量明顯下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,MTS結(jié)果顯示,ERK1-siRNA1、ERK2-siRNA2和ERK1-siRNA1+ERK2-siRNA2組細(xì)胞的增殖受抑制,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 針對(duì)ERK1/2的特異性siRNA能夠有效抑制血管平滑肌細(xì)胞中的ERK