豬流行性腹瀉病毒感染PK-15細(xì)胞miRNA表達(dá)譜變化及其對病毒增殖影響的初步研究.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV)引起的豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diahorrea，PED)是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的腸道傳染病。目前，還沒有有效的治療措施及治療藥物能對PED進(jìn)行治療?？刂坪皖A(yù)防PED的主要途徑之一是疫苗接種，但有研究表明有些豬場在接種該疫苗后，豬群還是被PEDV感染致病并大量傳播。究其原因可能是PEDV不同毒株之前發(fā)生了比較大的變異，致使

2、疫苗免疫失效。因此，找出更加有效地防治PED的手段具有重要意義。在生物機(jī)體內(nèi)miRNA是一類非編碼的小RNA。miRNA作用非常廣泛，能調(diào)控細(xì)胞的生長和分化以及新陳代謝和凋亡等重要的生命過程。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)具有抗病毒功能的miRNA越來越多，且miRNA發(fā)揮作用的區(qū)域可直接是病毒基因保守序列，所以miRNA對同一病毒的不同毒株都有抗病毒作用。
　　為研究豬流行性腹瀉病毒對PK-15細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響，將PEDV感染P

3、K-15細(xì)胞后，提取總RNA，進(jìn)行高通量測序，構(gòu)建感染PEDV的PK-15細(xì)胞以及未感染的細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，并進(jìn)行差異性分析。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有214個miRNA顯著性差異表達(dá)，其中175個miRNA表達(dá)上調(diào)，39個miRNA表達(dá)下調(diào)。選取10個顯著性差異表達(dá)的miRNA通過RT-qPCR進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示RT-qPCR驗證的各miRNA的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致。
　　為研究差異表達(dá)的miRNA對病毒增殖的作用，結(jié)合靶基

4、因預(yù)測、miRNA表達(dá)譜以及已報道與免疫有關(guān)的miRNA，本試驗選取ssc-let-7f以及其它6個miRNA合成miRNA minics轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中，并接種PEDV，取樣進(jìn)行熒光定量PCR，觀察轉(zhuǎn)染miRNA后PEDV病毒含量的變化，驗證各miRNA對病毒增殖的作用。其結(jié)果顯示，ssc-let-7f在12h、24h及36h的時候均對PEDV的增殖有明顯的抑制作用。說明ssc-let-7f對PEDV的體外感染有一定的抑制作用。